[发明专利]一种聚丙烯酰胺变性凝胶制作方法及其应用

说明书

本发明提供了一种聚丙烯酰胺变性凝胶制作方法及其应用，属分子生物学领域。该变性凝胶由40%甲叉双丙烯酰胺和去离子甲酰胺在催化剂过硫酸铵、加速剂四甲基乙二胺以及变性剂尿素作用下聚合而成。变性凝胶电泳所用样品为200 bp左右的PCR扩增片段，凝胶浓度为8%，凝胶变性范围为32%‑56%，过硫酸铵与四甲基乙二胺用量分别为90‑110μL、18‑25μL，电泳条件为60℃、60 V、16h。本发明能够提高凝胶质量和制作的稳定性，及确保实验精度的可靠性，对200 bp左右的PCR产物具有非常好的分离效果。

技术领域

本发明提供了一种聚丙烯酰胺变性凝胶制作方法及其应用，属分子生物学领域。

背景技术

聚丙烯酰胺变性凝胶主要用于变性凝胶电泳（DGGE），该项技术是根据引物扩增的PCR产物长度来确定聚丙烯酰胺凝胶的浓度，凝胶变性范围是从上到下由低变高呈线性梯度，在一定温度和电压下，PCR扩增出的DNA片段由点样孔向下运动，移动过程中遇到不同浓度变性剂，PCR产物长度一样但是碱基排列顺序不同且A、T之间由两个氢键连接，而C、G由三个氢键连接。若某DNA片段一点位为A、T，另一个DNA片段相同点位为C、G，当达到A、T断键所需条件时，A、T处断开但C、G依然稳定，这种现象被称为不同解链行为。解链程度不一样会致使电泳速率发生变化，当解链程度越大，迁移速率越低，若双链完全被打开时停留在凝胶的某一浓度处。正是不同序列PCR产物在聚丙烯酰氨凝胶中解链行为是不完全一样，在电泳移动过程中会停留在不同的位置，而被互相分开。

目前DGGE实验中变性凝胶是由尿素、40%甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺配制的凝胶溶液在凝胶系统中浇制而成。凝胶制作过程中存在以下问题：1）配制凝胶溶液所用试剂的质量直接影响凝胶质量；2）加速剂和催化剂的用量过多或过少对浇制时间和凝胶时间均有影响；3）凝胶浓度、变性浓度范围不合适会直接导致PCR产物在凝胶中的分离效果不佳；4）凝胶电泳时温度、电压、时间的选择不当也会导致PCR产物在凝胶中分离效果。

因此凝胶是DGGE实验的基础，其制作过程和应用条件十分关键。

发明内容

为了克服背景技术中的不足，本发明提供了一种聚丙烯酰胺变性凝胶制作方法及其应用，本发明能够提高凝胶质量和制作的稳定性，及确保实验精度的可靠性，对200 bp左右的PCR产物具有非常好的分离效果。

本发明采用方案是：

（1）聚丙烯酰胺凝胶制作方法

①使用40%甲叉双丙烯酰胺20 mL、50×TAE 2 mL、ddH₂O 78 mL制成0%凝胶母液，使用40%甲叉双丙烯酰胺20 mL、50×TAE 2 mL、ddH₂O 38 mL、去离子甲酰胺40 mL、尿素 42 g制成100%凝胶母液；

②向一个离心管中加入4.8 mL 100%凝胶母液、10.2 mL 0%凝胶母液配制32%变性凝胶溶液，向另一个离心管中加入8.4 mL 100%凝胶母液、6.6 mL 0%凝胶母液配制56%变性凝胶溶液；

③向变性凝胶溶液中依次加入100 μL过硫酸铵（APS）和18 μL四甲基乙二胺（TEMED），混匀，4 min内匀速完成灌胶，避光放置8 h。

注：尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺（美国Bio-Rad公司）；40%甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺（德国SIGMA公司）。

（2）步骤（1）所述凝胶的应用方法

①设置电泳槽温度60℃；

②PCR扩增产物与上样缓冲液以4：1混合；

③设置电泳仪设定电压60 v、时间16 h；

④电泳结束染色、成像。