[发明专利]高特异性MMP-14底物肽及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物酶检测领域，具体涉及一种高特异性MMP‑14底物肽及其制备方法和应用。该底物肽具有如式I所示的结构：其中，n为4‑30的整数，F1和F2分别为荧光基团及其对应的淬灭基团。本发明的底物具有高特异性，该底物以多肽及PEG结构为基础，在基质金属蛋白酶检测及癌症检测治疗应用方面具有广阔的前景。

技术领域

本发明涉及生物酶检测领域，更具体地，涉及一种高特异性MMP-14底物肽及其制备方法和应用。

背景技术

基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMPs)是一类自然进化中高度保守的，活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，其广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中。目前该家族已分离鉴别出28个成员，编号分别为MMP1-28。该家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成，包括疏水信号肽序列、前肽区(保持酶原的稳定)、催化活性区(Zn²⁺结合位点)、富含脯氨酸的铰链区和羧基末端区(与酶的底物特异性有关)。MMPs成员在上述共同结构的基础上各有特点，不同MMPs结构中底物结合区内侧残基侧链大小不同直接导致底物结合的差异性。根据作用底物的种类以及片断同源性，MMPs可分为6类：胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)；明胶酶(MMP-2、MMP-9)；间质水解酶(MMP-3、MMP-10、MMP-11)；基质水解酶(MMP-7、MMP-26)；膜型MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25)和其他分泌型MMP(MMP-19、MMP-21、MMP-23、MMP-27、MMP-28)。

MMPs的主要功能是降解细胞外基质的有效成分，在细胞迁移、血管生成、胚胎发育、动脉粥样硬化、肝肾纤维化疾病、恶性肿瘤的浸润与转移等病理生理过程中发挥重要的作用。通过对基质金属蛋白酶的检测，可以深度了解其性质及致病机理，并进一步了解病症的恶化程度，从而进行及时检测治疗。鉴于MMPs在生理和病理进程中起着关键性的作用，对于基质金属蛋白酶检测技术的研究开发是十分必要的。

MMP-14作为MMPs家中的重要一员膜蛋白，发挥着降解基底膜与细胞外基质以及调节细胞运动、生长、分化、凋亡等多种生命功能。研究表明，其在结肠癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的转移与侵袭中都扮演着重要的角色。研究还发现，MMP-14参与另两个重要的MMPs家族成员MMP-2、MMP-13酶原的激活过程，而这两个蛋白酶也已被实验证实与肿瘤的侵袭和转移紧密相关，换言之，MMP-14是研究肿瘤侵袭和转移机制中非常关键的一环，对其性质的深入研究将有望揭示致病机理，实现对疾病的有效诊断和治疗。

目前常见的MMPs酶活检测方法有：荧光明胶酶检测法、明胶酶谱法、DQ明胶原位酶谱分析、高效液相色谱法、肽链修饰的荧光探针技术以及荧光分子断层成像技术。其中荧光探针技术相比其它技术具有可实现“实时、可视、定量”的高灵敏度检测的潜力，具有一定的技术优势。目前报道的肽链修饰的荧光探针主要可以分为3类：酶活性荧光成像探针、靶向探针和交联成像探针。其中基于多肽的荧光探针是研究最广的酶活性成像探针。此类成像探针的底物是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理设计。FRET作为一种方便、快捷、灵敏的光学手段被广泛应用于化学分析、生物结构研究等领域，特别是在蛋白酶活性的测定中效果显著。

然而由于MMPs家族蛋白酶之间具有较明显的底物交叉活性，如何提高底物肽的特异性成为荧光类检测探针开发中的关键问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高MMPs乃至酶底物特异性的方法。该法通过在底物中引入适当的linker和具有特异性结合的非底物结合肽，极大提高了酶对底物催化的特异性。

为了实现上述目的，本发明提供一种高特异性MMP-14底物肽，该底物肽具有如式I所示的结构：