[发明专利]微滴式数字PCR探针法反应体系、检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种可以降低rain效应的微滴式数字PCR探针法反应体系、检测方法和应用。该微滴式数字PCR探针法反应体系，包括连续相试剂和分散相试剂；所述连续相试剂包括氟油与氟表面活性剂，所述表面活性剂为全氟聚醚和/或含全氟聚醚的嵌段氟化合物；所述分散相试剂为微滴式数字PCR反应试剂。通过在微滴式数字PCR探针法反应体系的连续相试剂中添加全氟聚醚和/或含全氟聚醚的嵌段氟化合物的氟表面活性剂，该氟表面活性剂可以作为微滴稳定剂，降低微滴的表面张力，使得在检测时生成的微滴具有均一直径、热稳定性高等特性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种微滴式数字PCR探针法反应体系、检测方法和应用。

背景技术

数字PCR(digital PCR，dPCR)方法发明于20世纪90年代末，并在此后获得迅速发展。与荧光定量PCR的整管PCR定量方式截然不同，数字PCR方法采用“有限稀释”分区和泊松分布算法等原理对初始模板进行绝对计数，从而达到临床需求的对肿瘤基因、病原基因等的绝对定量。将20-50μl含有待测模板、特异引物和探针的PCR体系均匀分散成少至768多至千万个分隔空间，并进行完整的PCR循环后，含有待测模板的分区会发出较强的荧光，而不含待测模板的分区则不会。通过泊松分布可以计算出加入体系中含有待测模板的绝对量，从而推算出病原体绝对数量、模板突变率、拷贝数变异、基因表达量等信息。当分区数量越多，待测模板分散越均匀，绝对定量也越精确。但随着分区的增加，数据量也呈几何级数增加，对设备和计算能力的要求越高。因此，在实际应用中，分区数与数据量之间通常会相互平衡。

数字PCR设备在21世纪初获得较大的进步，目前欧美国家推出了几款数字PCR仪，主要分为芯片式和微滴式。

2006年Fluidigm公司推出了第一台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国Inostics推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing数字PCR检测服务。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统，这也是目前数字PCR市场上最新型号的产品，其采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了数字PCR技术的发展。

近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术的发展，数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的最佳契机。伴随二代测序技术发展起来的“油包水PCR”技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，可以作为数字PCR的样品分散载体。QuantaLife利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术，并于2011年被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪继续在市场上销售。2013年Bio-Rad又推出了升级型号QX200。这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台。2012年，RainDance公司推出Raindrop型号数字PCR设备，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液。