[发明专利]利用Glycosylasparaginase酶释放及纯化制备还原性N‑糖链的方法

说明书

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种利用Glycosylasparaginase酶释放及纯 化制备还原性N-糖链的方法及该方法的用途。

背景技术

生物体中50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，糖蛋白在动物、植物、细菌、真 菌中广泛存在。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、 蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。

在真核生物中，糖蛋白分类是基于糖链与蛋白质的连接类型的，可分为：N-糖链和 O-糖链两大类。其中，糖蛋白的O-糖链是通过N-乙酰葡萄糖胺连接在蛋白质丝氨酸或丝 氨酸的羟基氧上，也有通过O-甘露醇等其他方式的连接。糖蛋白的N-糖链与蛋白质中的 天冬酰胺残基(Asn)的氨基侧链共价相连，在动物细胞中，几乎都是N-乙酰葡萄糖胺 与Asn残基以β-苷键构型相连。N-糖链不仅介导细胞之间的识别以及信号转导过程，还 在蛋白质的稳定性、定位以及受体之间的相互作用中具有重要的生物学功能和意义 Weixuan Chen；et al.Journal of Proteome Research,(2014),13(3):1466-1473。

在植物和昆虫中N-糖链普遍存在α-1,3-岩藻糖(Fucose，简称Fuc)修饰。研究表 明，由于植物中糖链的这种特殊结构修饰，将植物糖蛋白注入到人体会产生免疫交叉反 应，即引起过敏反应，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8):1463-1474。树 木花粉、蜂毒等都是主要的过敏原，而且通常与食物引起的过敏反应息息相关，但是有 关这些物质寡糖结构的分析报道较少，Wei Song；et al.Journal of Proteomics,(2011),74(8): 1463-1474。主要是由于缺乏对这类N-糖链的特异性、高效的分析方法和手段。

由于完整的糖蛋白分子量较大，很难直接对其中的N-糖链进行分析。因此，一般需 要将N-糖链从蛋白上释放下来，才能进行下一步的分析检测，因此，糖链的释放在糖链 分析中是一个非常关键的环节，对糖蛋白糖链结构和功能的分析研究有重要意义。由于 生物体内N-糖链表达的微量性和复杂性，同时又具有多羟基，一般需对糖链进行化学衍 生以改变其疏水性，便于后续多重分析模式和方法，如高效液相色谱(HPLC)，质谱 (MS)和毛细管电泳(CE)等进行高效的分析。因而高效获取还原性N-糖链对糖类物 质进行后续的结构和功能研究尤为重要。

目前，糖蛋白N-糖链的释放主要采用特异性酶解法和化学法。常见的化学法有肼解 法，即糖蛋白在无水肼中于90℃反应4h可以非还原性的释放糖链，此方法虽通用性好， 但是无水肼有剧毒，容易爆炸，且反应过程中，N-乙酰氨基中的酰基易脱落。糖蛋白还 可以在氢氧化钠(NaOH)和硼氢化钠(NaBH₄)体系中进行解离，糖蛋白在氢氧化钠 碱性介质中能解离出还原性N-糖链，由于脱乙酰化副反应十分严重，并且还原性糖链在 强碱性的水性介质中会发生降解，在反应体系中加入硼氢化钠等还原剂，使得解离下来 的糖链主要生成还原端为醇羟基的糖醇产物，该产物不可进行荧光标记，不利于后续的 分离分析。糖蛋白在浓氨水和饱和的碳酸钠中释放还原性N-糖链的方法，水解后一部分 核心α-1,3-岩藻糖(α-1,3-Fuc)糖基化还原性N-糖链在碱性环境下会发生peeling降解，不 利于后续的分析。