[发明专利]一种重组短短芽孢杆菌的构建方法

说明书

一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：首先合成猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Porcine GM‑CSF）基因与短短芽孢杆菌（pNY326）质粒；再用BamHI和EcoRI分别对Porcine GM‑CSF基因和pNY326质粒进行双酶切，于37℃温箱反应3h；使用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收Porcine GM‑CSF基因和pNY326质粒的酶切产物，并将回收的双酶切产物进行4℃过夜连接反应；将连接反应产物直接电转化短短芽孢杆菌SP3，电转完成后进行30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；将复苏好的转化产物用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。本发明可快速、简便的获得猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。

技术领域

本发明涉及一种重组短短芽孢杆菌的构建方法。

背景技术

短短芽孢杆菌是一种安全、无毒性的益生菌，同时具有蛋白分泌能力强和胞外蛋白酶活性低的特点，因此特别适合做为胞外分泌蛋白表达系统。

集落刺激因子（CSF）是一组在体内外均能刺激骨髓造血干细胞分化成细胞集落的低分子细胞因子。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子可刺激前粒细胞单核细胞分化生成粒细胞和单核细胞。集落刺激因子是机体最重要的细胞因子之一，在免疫细胞分化过程中发挥重要作用，可做为免疫增强佐剂以增强疫苗的免疫原性，本发明合成了猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，并与质粒pNY326构建了重组质粒，成功电转化短短芽孢杆菌SP3，获得了表达猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组短短芽孢杆菌，重组猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的高效表达为其做为猪用疫苗免疫增强剂的广泛使用奠定了基础。

发明内容

本发明其目的就在于提供一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，具有快速、简便的获得猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的特点。

为实现上述目的而采取的技术方案是，一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）合成猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Porcine GM-CSF）基因与短短芽孢杆菌（pNY326）质粒；

（2）用BamHI和EcoRI分别对Porcine GM-CSF基因和pNY326质粒进行双酶切，于37℃温箱反应3h；

（3）使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳回收Porcine GM-CSF基因和pNY326质粒的酶切产物，并将回收的双酶切产物进行4℃过夜连接反应；

（4）将连接反应产物直接电转化短短芽孢杆菌SP3，电转完成后进行30℃摇床80rpm缓慢复苏1h；

（5）将复苏好的转化产物用新霉素抗性筛选转化子，获得重组短短芽孢杆菌。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明可快速、简便的获得猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为本发明中Porcine GM-CSF-pNY326重组质粒的PCR鉴定图；

图2为本发明中短短芽孢杆菌为SP3表达Porcine GM-CSF纯化蛋白的western blot图；

图3为本发明中pNY326质粒图谱；

图4为本发明中pNY326质粒的多克隆位点图谱。

具体实施方式

一种重组短短芽孢杆菌的构建方法，如图1-4所示，包括以下步骤：

（1）合成猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Porcine GM-CSF）基因与短短芽孢杆菌（pNY326）质粒；