[发明专利]肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种肝硬化的血清糖蛋白N‑糖组图谱模型的建立方法。所述方法采用G‑Test检测方法检测血清糖蛋白N‑糖组图谱，建立肝硬化患者和正常对照人员具有显著差异的N‑糖组图谱模型，筛选出肝硬化组和正常对照组间存在显著表达差异的NA3。基于本发明方法构建的N‑糖组图谱模型，对肝硬化的检测灵敏度和特异性分别达到84.3％和85.0％。在后续应用中，通过比对待检测人员血清的N‑糖组图谱中与本方法建立的图谱模型中单峰NA3的峰值，能够对待检测人员的肝硬化程度进行检测。基于本发明方法，能够让众多肝硬化患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测肝硬化的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种肝硬化的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法。

背景技术

肝硬化(cirrhosis)是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。目前认为引起肝硬化前三位最主要的原因有酒精、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒感染(hepatitis C virus,HCV)。全球范围内，57％的肝硬化是由乙型肝炎病毒(30％)和丙型肝炎病毒感染(27％)引起的，在发展中国家，主要由乙型肝炎病毒引起肝硬化。

肝硬化临床诊断过程中需综合考虑包括临床表现、实验室检查、组织学、影像学及组织病理学诸多依据。肝组织活检可提供肝纤维化分期的重要信息，肝组织学中弥漫性肝纤维化伴假小叶形成。由于肝组织活检存在一定风险，且单个肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体纤维化程度，因此，近年来发展了多项非创诊断技术用于评估肝纤维化，包括测定肝脏硬度的影像学技术、血清学标志和各类评分系统等。血清生化直接指标主要包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原肽和IV型胶原等，间接指标主要包括血小板计数(PLT)、r-球蛋白、凝血酶原时间(PT)、谷丙转氨酶、胆红素和载脂蛋白A1等，但是上述指标诊断肝硬化均缺乏特异性。各种常用的影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像(MRI)等可以发现肝包膜增厚、肝表面轮廓不规则、肝实质的回声不均匀增强或CT值增高或呈结节状、各叶比例改变、脾脏厚度增加及门静脉和脾静脉直径增宽等肝硬化和门脉高压的征象。彩色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流情况。尽管不少研究发现肝脏超声半定量打分与肝组织纤维化分级有良好的相关性，但是目前来说对早期肝硬化不够敏感，对于纤维化的诊断难以定量化。肝脏弹力测定主要包括瞬时弹性波扫描(Fibroscan)和核磁共振弹性测定技术(magnetic resonanceelastography)。此类技术的优点是能够测定更大的范围甚至整个肝脏的弹性情况，在一定程度上弥补了肝活组织检查存在的取样误差不足；其缺点为肝脏脂肪沉积、腹水、腹腔炎等情况可影响测定效果。此类技术尚不能区分相邻的肝纤维分期，但对于诊断代偿性肝硬化有一定的临床指导意义。

糖蛋白是通过蛋白质的翻译后修饰即糖基化后形成的一类结合蛋白。蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。糖蛋白具有多种生物功能。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。

糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，目前糖链结构的分析方法主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：该方法分辨率高、检测速度快和重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。