[发明专利]一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法

说明书

本发明提供一株发酵木糖生产衣康酸的树干毕赤酵母合成菌株及构建方法。采用树干毕赤酵母Pichia stipitis FPL‑UC7为宿主，异源表达经密码子优化的来自土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因CAD，进一步过表达树干毕赤酵母的细胞质顺乌头酸酶基因ACO，获得了优化的树干毕赤酵母衣康酸合成菌株；将获得的合成菌株进行3L发酵罐补料发酵木糖实验，发酵5‑7天，衣康酸产量达到1.5g/L。

技术领域

本发明属于合成生物学和生物能源技术领域，具体涉及一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法。以树干毕赤酵母(Pichia stipitis FPL-UC7)为宿主，异源表达密码子优化的衣康酸合成途径，过表达细胞质顺乌头酸酶基因ACO，获得树干毕赤酵母衣康酸合成菌株，并在发酵培养基中高效发酵木糖生产衣康酸的方法。

背景技术

衣康酸作为一种重要的C₅二羧酸化合物，被美国能源部列为二十一世纪有限发展的12中平台化合物之一，可广泛应用于化工、医药、农业等领域，具有极其广阔的市场和应用价值。衣康酸的生产方法有微生物发酵粉和化学合成法。化学合成法又可分为柠檬酸合成法和顺酐合成法，因柠檬酸合成法生产成本较高，工业上已不再采用，而顺酐法虽然生产成本低、选择性高，但未实现工业化。而生物发酵粉因原料易得，工艺技术成熟等优点成为国内外工业化生产衣康酸的主导方法。现阶段，微生物发酵生产衣康酸的工程菌株主要是土曲霉类Aspergillus terreus。然而，由于土曲霉类的复杂生长形态，限制了发酵过程的可控性和工业化规模；同时由于该丝状真菌的特异性重组频率低，基因工程手段在其菌种改造方面仍很困难，这些因素限制了衣康酸产量的进一步提高。近年来，采用合成生物学，使用非曲霉菌生物合成衣康酸的研究得到了广泛发展。利用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌及酵母菌等模式菌株为宿主，异源表达衣康酸合成途径，用葡萄糖或甘油为碳源经发酵后衣康酸产量达到0.17-7.8g/L(Trinh CT(2012)Elucidating and reprogramming Escherichiacoli metabolisms for obligate anaerobic n-butanol and isobutanol production.Appl.Microbiol.Biotechnol.95(4):1083-1094)。然而，以木糖等价格更为低廉的原料为碳源，采用合成生物菌株发酵生产衣康酸的研究未见报道。

作为木质纤维素的重要组成部分，木糖在总的单糖中能占到30％，因此高效利用木糖生产目标代谢物是发展生物质经济的关键问题之一。自然中存在能够天然代谢木糖的微生物，如树干毕赤酵母具有宽广的碳源代谢能力，能高效代谢木糖，同时具有耐低pH和高糖等优点。利用树干毕赤酵母发酵木糖产乙醇、富马酸已见报道(Trinh CT(2012)Elucidating and reprogramming Escherichia coli metabolisms for obligateanaerobic n-butanol and isobutanol production.Appl.Microbiol.Biotechnol.95(4):1083-1094)。这些结果为利用该菌株发酵木糖合成衣康酸奠定了理论基础和操作平台。

本发明首次以树干毕赤酵母(Pichia stipitis FPL-UC7)为宿主，异源表达经密码子优化的来源于土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因CAD，构建衣康酸合成途径，并过表达宿主菌的细胞质顺乌头酸酶基因ACO。获得了树干毕赤酵母衣康酸合成菌株，并在发酵培养基中高效发酵木糖生产衣康酸。

发明内容

本发明提供了一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法。采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母Pichia stipitis FPL-UC7为宿主，异源表达经密码子优化的来自土曲霉的顺乌头酸脱羧酶CAD，进一步过表达树干毕赤酵母FPL-UC7细胞质顺乌头酸酶ACO，获得了树干毕赤酵母衣康酸合成菌株。本发明构建过表达CAD和ACO基因的生产衣康酸工程菌株方法，对开发生物质生产衣康酸具有现实意义和指导价值。本发明采用如下技术方案。