[发明专利]用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，所述的磁球纳米复合物包含以下组分：磁球纳米金复合物、发夹DNA探针、二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金、与发夹DNA探针环状部分互补的miRNA。所述用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，包含以下步骤：首先制备磁球纳米金复合物，然后将两种发夹DNA探针在磁球纳米金复合物表面固定，最后是miRNA的杂交以及二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金的固定。本发明提供的用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物具有制备简单、电化学响应强、检测灵敏度高等优点。

技术领域

本发明属于电化学传感技术领域，具体涉及一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一种包含17～25个核苷酸的内源性的、非编码的单链RNA，它在基因表达调控过程中发挥着非常重要的作用。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA，长度大约为300～1000个碱基，pri-miRNA在细胞核内经Drosha酶的作用形成具有发夹结构的pre-miRNA，其长度大约为70～90个碱基，pre-miRNA被转运到细胞质经Dicer酶酶切后，成为长约17～25个核苷酸的成熟miRNA。miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，其表达水平的高低可为癌症的临床诊断及药物开发提供重要的依据。

目前，miRNA定性和定量的检测技术主要有：Northern blotting印迹法、聚合酶链式反应(PCR)、微阵列芯片(microarray)、滚环扩增等，这些方法都是通过碱基互补配对原理进行杂交，然后结合分离、标记以及荧光、电化学等方法对miRNA进行分析检测。其中，Northern blotting印迹法是一种半定量的检测方法，步骤繁琐且耗时、灵敏度不高。PCR技术能够对miRNA进行高灵敏、高特异性的定量检测，但该方法步骤繁琐，需要对miRNA进行预处理。Microarray法虽然在短时间内能快速、高通量地检测大量miRNA序列，但其成本高，无法区分碱基相差很小的同族miRNA序列。“CN 105950711A”公开了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物，但是该复合物只能检测一种miRNA序列。单一基因可由多种miRNA共同调节，因此有必要发展一种同时检测多种miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物及其制备方法。该纳米复合物可用于检测两种miRNA序列，具有制备简单、电化学响应强、检测灵敏度高等优点。

本发明提供了一种用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物，包含以下组分：

a)磁球纳米金复合物；

b)两种发夹DNA探针；

c)二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金；

d)与发夹DNA探针环状部分互补的miRNA。

所述的磁球纳米金复合物磁球半径为100nm～3μm，优选2.5μm～2.8μm。

所述的发夹DNA探针，环状部分为17～25个碱基，茎部为5～10个碱基。

所述的二茂铁修饰的纳米金和亚甲基蓝修饰的纳米金为末端标记了二茂铁的DNA修饰的纳米金和末端标记了亚甲基蓝的DNA修饰的纳米金。

所述标记二茂铁或亚甲基蓝的DNA片段中包含5～20个A碱基序列和其它非A碱基序列。

本发明用于检测miRNA的二茂铁和亚甲基蓝双重标记的磁球纳米复合物的制备方法，包含以下步骤：

(1)磁球纳米金复合物的制备