[发明专利]一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于分子条形码标记的大量组织、细胞mRNA建库、测序新方法，可用于高通量同时测序大量样本mRNA表达量，解析各个样本基因表达情况。

背景技术

随着精准医疗计划的进展，高通量基因测序技术将在以后的疾病精确诊断、疾病亚型分类、精准监控疾病发生发展、精准指导用药、特异疾病相关基因组数据库建立等方面发挥越来越关键作用。尽管测序成本已经显著降低，然而一旦涉及高通量、大量样本的测序，成本依然较高。

传统mRNA测序前的文库制备往往是一个样本构建一个测序文库，而且是基因全长建库，然后将构建的文库混合后测序，构建测序文库的高成本将极大限制所能检测的样本数量，较难实现大量样本同时检测；而且由于是基因全长建库，一旦样本数量增加，测序成本也极大增加，因此极大限制了其广泛的运用。

因此，基于现有方法的以上不足，本发明了一种大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)的分子条形码标记、文库构建、测序的新方法。

发明内容

本发明包含将大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)标记分子条形码、逆转录、合成第二条链、文库构建及二代测序整个流程的新方法。所述方案能够精准地将提取的每个样本mRNA都标记上独特的分子条形码，并通过高效的逆转录、合成第二条链将每个样本的mRNA转换成带有独特分子条形码标签的双链DNA，随后通过优化的文库构建方法，可将大量标记了分子条形码的样本混合后，实现高通量样本文库构建及二代测序检测。该分子条形码标记测序方法与现今主流的单个样本文库建库及测序方法比较，极大的降低了构建测序文库及测序的成本。该方法可实现高通量多样本同时建库、测序，可用于研究高通量筛选不同处理因素对同一细胞、组织的影响、或一种处理对全身多个不同组织影响、大量临床样本mRNA测序、或实时活检多个人群血液淋巴细胞表达谱的改变等高通量研究。

本发明采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于对大量(多个)组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)逆转录的含分子条形码的寡核苷酸引物序列组合：该序列组合含多个不同且唯一的条形码(barcode)及oligo-dT的寡核苷酸链。

优选地，所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illumina i5测序引物序列(如序列ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。

本发明方法针对的对象即大量的组织、细胞样本的样本数数量范围在1-5000之间均适用，相应的上述序列组合中寡核苷酸链的数量优选为1-210个之间。

优选地，当样本数量为1-40个时，该序列组合中寡核苷酸链数量(即X(N)的数量)跟样本数量一致，(比如当样本数量为6个时，该序列组合含6个不同且唯一的条形码及oligo-dT的寡核苷酸链)，当40＜样本数量≤960个时，该序列组合中寡核苷酸链数量为40个(如样本数量为100、200、300时，该序列组合中寡核苷酸链数量为40个)；当960＜样本数量≤5000个时，该序列组合中寡核苷酸链数量至少大于样本数/24，且数量为整数。

优选地，该序列组合中，多个寡核苷酸链之间Z1序列相同，T(18-30)中T碱基数量相同。

本发明中所述大量组织、细胞样本是含polyA尾巴的mRNA的真核生物(例如酵母、小鼠、人、蝾螈等)的正常或异常病变的组织、细胞样本。

本发明还提供了一种通过逆转录对大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)分子进行条形码标记的方法，该方法包括：

mRNA的提取、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本(取1-1000ng总RNA)加入含唯一且不同条形码(barcode)及oligodT的寡核苷酸链(1-10μM)作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illumina i5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。

逆转录反应试剂可以兼容任何商业化逆转录酶及缓冲体系。