[发明专利]Hg‑snb1基因片段介导的RNAi载体及其在培育抗大豆胞囊线虫转基因植物中的应用

说明书

技术领域

本发明为植物基因工程技术领域，涉及一种Hg-snb1基因片段介导的RNAi载体及其在培育抗大豆胞囊线虫转基因植物中的应用。

背景技术

大豆胞囊线虫病(Soybean cyst nematode，SCN)是由大豆胞囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)引起的一种世界性大豆病害，在世界各大豆主要生产国如美国、巴西、阿根延、中国等均广泛分布。据统计，SCN每年可造成大豆减产7％～10％，严重地块可达15-50％，甚至绝产，每年造成约10-15亿美元的经济损失。SCN在我国东北和黄淮海大豆主产区均有发生，其中又尤以黑龙江省、吉林省中西部及内蒙古的盐碱地、白浆土和沙壤土地发生较为严重，每年危害面积达2.0×10⁶hm²以上。除危害大豆外，SCN还危害小豆，赤小豆、饭豆、菜豆等170多种作物。

大豆胞囊线虫是一种定居型内寄生线虫，主要通过2龄幼虫侵染大豆根部维管束，危害大豆生长发育，造成植株发育不良，根系减少，根上附有白色的球状物，茎和叶变淡黄色，豆荚和种子萎缩瘪小，甚至不结荚。大豆胞囊线虫是严格的专性寄生物，存在明显的寄主分化现象，不同生理小种致病性存在明显差异。按照Riggs等提出的分类标准，SCN存在16个生理小种。目前在我国已发现1、2、3、4、5、7、14号小种，其中东北大豆产区主要是3号小种，另外还有1号、4号和14号；黄淮海大豆产区主要以1号和4号小种为主。

SCN作为一类土传病害，其分布与大豆种植区域高度重叠，是一种极难防治的土传病害。由于目前尚无有效可使用的化学杀线虫剂，生产上主要通过种植抗性品种和田间轮作控制SCN的发生与危害。由于胞囊在土壤中存活时间较长(9年以上)，采用轮作等方式虽然可以减少大豆产量损失，但并不能完全控制SCN的危害，实际应用效果有限。目前生产上利用的抗线虫大豆品种主要来源于Peking、PI 88788等少数几个抗源品种，其中，具有Peking或PI 88788血缘的品种占所有抗线虫大豆品种的97％以上，抗性遗传基础极为狭窄。同时，由于大豆胞囊线虫生理小种较为复杂，易造成线虫产生抗性，目前已报道多个胞囊线虫生理小种对PI88788血缘的抗线虫品种产生了抗性。因此，如何进一步开发新型抗线虫资源，拓宽抗性资源遗传基础，加快抗线虫大豆品种的选育是我国抗病大豆育种中面临的主要问题之一。

RNA沉默(RNA interference，RNAi)是植物抵抗外来核酸(病毒、转座子等)入侵以保持自身基因组完整性的一种防御机制。双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)导入细胞后被切割成21-23个核苷酸长度的短核苷酸双链，在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致该同源mRNA降解，进而导致内源基因发生沉默。RNAi作为一种简单有效的基因敲除的工具，已广泛应用于秀丽隐杆线虫(C.elegans)等多种线虫基因功能研究及转基因研究。目前，国际上已完成基因组测序工作的线虫有10种(Nematode.net)，其中2种为植物寄生线虫，包括北方根结线虫(Meloidogyne hapla)和南方根结线虫(M.incognita)。截至2011年，Nematode.net数据库中已经有超过一千万个ESTs序列和二十多万个来自50多种线虫的基因组序列。尽管目前H.glycines基因组测序工作尚未完成，但利用已有的ESTs数据库信息，结合模式生物C.elegans生物学数据信息，筛选与大豆胞囊线虫寄生、发育及繁殖等相关的关键基因，开展大豆胞囊线虫基因功能验证和转基因研究提供了极大的便利。