[发明专利]基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法

说明书

本发明公开了一种基于流式结合ICP‑MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，属于流式细胞术的样品前处理技术领域。本发明包括(1)全血样本的采集和运输，(2)PBMC细胞分离，(3)细胞活性染色，(4)细胞刺激，(5)细胞固定，(6)表面抗体染色，(7)胞内磷酸化蛋白染色和(8)单细胞标记等步骤，将金属元素标签标记的抗体与细胞表面抗原结合，将标记好的细胞与作为内参用于标准化的beads混合，前处理过程中区分死细胞与活细胞，以免出现死细胞数量过多影响实验结果的分析与阐述，区分单细胞与细胞二聚体、三聚体甚至多聚体，能很好的满足流式结合ICP‑MS单细胞蛋白检测需求。

技术领域

本发明属于流式细胞术的样品前处理技术领域，更具体地说，涉及一种基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，特别涉及人外周血样本的前处理方法。

背景技术

流式细胞术是一种采用激光束激发单行流动的细胞，对它的散射光和携带的荧光进行探测，从而完成对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、微生物学、制药学、生殖学等领域。作为最普遍使用的单细胞技术之一，流式技术一直在生物学各研究领域都有着广泛的应用。一直以来，流式技术是分析复杂细胞群体的重要手段，它可以实现对细胞进行多参数分析，从而区分不同种类的细胞；其所能检测参数的多少，也决定了我们对于所研究群体异质性的了解程度。

目前流式细胞术的样品前处理方法基本都是进行荧光染料标记，具体前处理方法为：1)收集2×10^6个细胞，用1mL冷的PBS重悬，1500rpm离心5min，弃上清；

2)拍打混匀细胞团块，随后加入1uL荧光直标的CD45抗体，混匀，冰上避光孵育15min；

3)加入1mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

4)加入1mL 1％中性多聚甲醛(注：用PBS将4％的多聚甲醛稀释为1％浓度使用即可)重悬细胞，避光固定15min，随后1500rpm离心5min，弃上清；

5)加入1mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

6)用1mL含0.09％皂素的PBS重悬细胞，冰上避光放置10min，1500rpm离心5min，弃上清；

7)加入1mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

8)以200uLPBS重悬细胞，加入Hsp70抗体，冰上避光放置30min，再用1mL冷的PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的一抗；

9)加入1mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

10)以200uL PBS重悬细胞，加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40min后，再用1mL冷的PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，洗去未结合的二抗；

11)加入1mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；

12)以200uL PBS重悬细胞，避光备用；上机检测，每样品计数5000-50000个细胞。

荧光染料的标记与金属标签标记细胞的原理不同，处理方法也迥异。故现有标记方法进行前处理的样本无法很好的应用于基于流式结合ICP-MS进行人外周血样本单细胞蛋白检测。样本前处理的方法研究阻滞，将严重影响新型检测方法检测技术的发展与应用。

发明内容

1.要解决的问题