[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测沙门氏菌的方法

权利要求书

1.用于检测沙门氏菌(Salmonella spp.)的LAMP引物组，其特征在于，包括：

外侧正向引物F3：5’-GGATGACTCGCCATGGTATG-3’；

外侧反向引物B3：5’-TTGTTCAACAGCTGCGTCA-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-CTGGGCGACAAGACCATCACCATTTGTCCTCCGCCCTGT-3’；

内侧反向引物BIP：5’-TCCCCGCATTGTTGATTGCGATCCGCCCCATATTATCCGTA -3’；

其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

2.用于非诊断用途的基于核酸层析生物传感技术检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待测样品DNA，以DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP-PCR扩增反应；

S2、取10μL步骤S1的LAMP-PCR扩增产物，与50μL反应缓冲液混合后滴加到纳米酶核酸层析试纸条的样品垫上，5-20min后，在测试线和质控线上滴加2滴底物缓冲液，反应5min后通过肉眼观察显色情况，判读结果：阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；失效反应：若质控线不显色，则检测失败或试纸条失效；

对于定量测量，采用与条带读取器软件组合的便携式条带读取器记录条带的光学强度，根据光学强度计算出待测样品中沙门氏菌的含量；

其中，步骤S2中所述反应缓冲液为：4×SSC，0.2m/m％吐温-20；所述底物缓冲液中含有20×DAB和20×H₂O₂；

所述纳米酶核酸层析试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)Fe₃O₄磁颗粒的制备；

2)纳米酶探针的制备：将Fe₃O₄磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；

3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；

①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；

②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

3.根据权利要求2所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述纳米酶核酸层析试纸条的制备方法步骤1)中利用水热法合成Fe₃O₄磁颗粒，具体为：将0.6-0.8g FeCl₃·6H₂O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸钠，搅拌30-40min，然后密封在高压釜中，200℃加热16-18h；磁颗粒产物用乙醇洗涤，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5-8mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5-8mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30-40min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤，即得Fe₃O₄磁颗粒。

4.根据权利要求3所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述纳米酶核酸层析试纸条的制备方法步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物素二抗加入50mM pH 6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5-8mg的Fe₃O₄磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤混合物，然后在50mM pH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30-40min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。

5.根据权利要求2所述检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述纳米酶核酸层析试纸条的制备方法步骤2)和3)中所述的生物素二抗为羊抗鼠IgG；步骤3)中所述硝酸纤维素膜为Millipore135S。