[发明专利]一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，所述方法通过一株可识别ISKNV病毒主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体作为捕获抗体捕获待测样品中的有效抗原，通过另一株识别传染性脾肾坏死病毒MCP不同抗原表位的单克隆抗体作为检测抗体对捕获的有效抗原进行定量。本发明所述方法及应用本方法的试剂盒具有灵敏度高、线性范围广、使用方便、所需时间短等优点，可用于传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗生产过程中半成品和成品中有效抗原含量的测定，为传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗质量控制提供了一种新的方法，可保障疫苗质量、提高疫苗生产效率。

技术领域

本发明涉及一种疫苗有效抗原含量测定方法，尤其是一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒。

背景技术

鳜(Siniperca chuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜养殖业发展的主要瓶颈，自1997年以来，鳜暴发性传染病对鳜养殖业带来巨大的经济损失。吴淑勤等首次确认了一种截面呈六角形，直径约 150nm的大型球状病毒颗粒为鳜暴发性传染病的主要病原。由于该病毒主要感染鳜的脾和肾脏，何建国等将其命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)，隶属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属，其全基因组测序已完成。该病感染鳜的主要临床症状表现为脾肾肿大、充血、紫黑色。由于传染性脾肾坏死病毒病发病率高、致死率高、造成经济损失大，其防控技术研究成为鱼病研究者重要课题之一。疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效的手段，针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒，目前已研制出细胞灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗，其中细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定等优势而成为最具产业前景的疫苗之一。在鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗生产过程中，疫苗质量评价主要采用抗原灭活前病毒滴度的测定以及灭活后鱼体免疫攻毒试验，但病毒滴度的测定依赖于活病毒，病毒灭活后的半成品及成品无法通过此方法对抗原进行定量，而鱼体免疫攻毒试验周期长、需强毒攻击存在病毒扩散等生物安全风险，在实用性和生物安全方面均存在弊端。因此，创制出快速简便的传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法成为鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗质量控制急需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法及试剂盒。

一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，所述方法通过一株可识别ISKNV病毒粒子主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体作为捕获抗体捕获待测样品中的有效抗原，通过另一株针对传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白不同抗原表位的单克隆抗体作为检测抗体对捕获的有效抗原进行定量。

进一步的，所述方法以鼠抗ISKNV MCP抗原单克隆抗体株1C8 1B9作为包被单抗，然后以生物素标记的识别ISKNV MCP另一抗原表位的单克隆抗体株3B12 6B3作为检测抗体，以辣根过氧化物酶标记亲和素 (HRP-avidin)作为二抗，四甲基联苯胺(TMB)显色，建立了生物素-亲和素双抗体夹心ELISA(BA-ELISA) 检测方法。

进一步的，所述标准曲线的绘制为将制备的ISKNV抗原重组蛋白稀释至300ng/mL-1000ng/mL，优选 300ng/mL后，进行2倍系列稀释，以ISKNV抗原浓度为纵坐标，对应的A450值为横坐标，绘制标准曲线。

进一步的，一种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗有效抗原含量测定方法，具体包括以下步骤：

(1)ISKNV的增殖与纯化；

(2)重组蛋白表达与纯化；

(3)杂交瘤细胞株的筛选；

(4)单克隆抗体腹水的制备；

(5)双抗体夹心BA-ELISA法的建立。