[发明专利]一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用

说明书

本发明涉及一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用方法，通过对少量的活检肿瘤组织进行培养及传代，可培养出与其来源癌组织遗传背景高度一致，其遗传突变与对应组织标本中的突变高度匹配的类器官，同时培养的类器官还可以冻存和复苏，培养和药效测试时间较短，培养成本较PDTX模型经济，建立肿瘤类器官标本库可以实现高通量筛选药物，培养的类器官可以测试样本射线敏感性等等，应用广泛。

技术领域

本发明涉及肿瘤类器官培养的方法，具体是一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用。

背景技术

在肿瘤研究中，特别是在新型药物的筛选，个体化治疗的评估研究上 PDTX模型(人来源肿瘤异种移植于免疫缺陷小鼠模型)取得一定的成效，移植肿瘤也保留了原代肿瘤的分化程度、形态特征、结构特点以及分子生物学基本特性和肿瘤微环境。但是，这种模型也有它的缺陷之处，PDTX模型虽然模拟了原代肿瘤的生物学特性，能为肿瘤的研究提供体内模拟环境，但这种模型的建立毕竟不是完全和原代肿瘤相同，而且成瘤模型时间长，建立模型相对困难，免疫缺陷动物成本高，同时也存在一定的伦理问题。PDTX 模型，在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤的研究中均有报道。但我们可以看到，这种肿瘤移植模型的建立是比较困难的，特别是一些肿瘤位置例如消化道肿瘤，因其原位处于消化道腔内，其移植的成活率和成功率都是很低的，因此阻碍了其广泛应用，只限制于某些特殊肿瘤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种活检肠道肿瘤类器官的培养方法，包括如下步骤：

1)取米粒至黄豆大小的活检肿瘤组织并置于冰PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液中；

2)采用预冷5-10分钟的PBS(penicillin100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液多次冲洗干净活检肿瘤组织；

3)无菌切碎肿瘤组织并移入预热至37℃的酶消化液中，震荡消化 30-60分钟；

4)消化完毕后使用移液枪反复吹打直至肿瘤碎片消失，并以 100g-300g转速离心5分钟；

5)去除上清，60gx 5分钟反复离心多次；

6)去除上清，加10ml预冷PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液，取10ul显微镜下观察计数隐窝数量， 100-300g 5分钟离心，去干净上清，以100-300个隐窝/50ul Matrigel比例重悬3D培养类器官。

还提供一种活检肠道肿瘤类器官的传代方法，包括如下步骤：

1)取根据上述方法制备的原代类器官，去除培养基，1ml PBS 缓冲液清洗一遍去除液体，重新加入1ml冰PBS缓冲液，用枪头反复打碎Matrigel，移入50ml离心管；

2)100g-300g离心5分钟，去除上清，加冰PBS缓冲液重悬，反复吹打，此步骤重复3-5次至无凝胶存在，类器官被均匀打碎；

3)最后一次离心后，去干净PBS缓冲液，Matrigel重悬，按照 1∶3-1∶5比例接种培养。

还提供一种活检肠道肿瘤类器官的冻存和复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)冻存：传代类器官培养3-5天后，按照传代方法步骤1)-2) 中的清洗方式清洗至最后一次，去除PBS缓冲液后加入 95％FBS+5％DMSO制成的冻存液，将冻存盒放入-80℃冰箱，16小时后移入液氮存放；