[发明专利]一种利用植物维生素C合成途径构建生产维生素C大肠杆菌菌株的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌从葡萄糖一步合成维生素C方法，包括如下步骤:

步骤1，将改造的植物维生素C合成途径相关的11个基因构建成T7启动子和终止子调控的表达元件；所述的11个基因来源于草莓(Fragaria ananassa Duch)，分别为：

改造的草莓己糖磷酸激酶基因FVHXK1：从草莓中克隆己糖磷酸激酶基因并利用定点突变方法将90位XhoI限制性内切酶位点；229位HindIII限制性内切酶位点；632位SacI限制性内切酶位点；720位KpnI限制性内切酶位点；935和1148位BgII限制性内切酶位点；1238位BamHI限制性内切酶位点；1342位EcorI限制性内切酶位点消除；改造的草莓己糖磷酸异构酶基因FVPGI：从草莓中克隆草莓己糖磷酸异构酶并利用定点突变方法将264位XbaI限制性内切酶位点；293位SacI限制性内切酶位点；1126位BamHI限制性内切酶位点；1294位SphI限制性内切酶位点；1504位BgII限制性内切酶位点消除；

改造的草莓磷酸甘露糖异构酶基因FVPMI：从草莓中克隆甘露糖异构酶基因并利用定点突变方法将817位HindIII限制性内切酶位点；1038位KpnI限制性内切酶位点；1110和1221位PstI限制性内切酶位点消除；

改造的草莓磷酸甘露糖变位酶基因FVPMM：从草莓中克隆磷酸甘露糖变位酶基因并利用定点突变方法将139位BamHI限制性内切酶位点；537位HindIII限制性内切酶位点消除；

改造的草莓GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因FVVTC：从草莓中克隆GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因并利用定点突变方法将367位EcoRI限制性内切酶位点；904位SphI限制性内切酶位点消除；

改造的草莓GDP-D-甘露糖-3，5-表异构酶FVGME：从草莓中克隆GDP-D-甘露糖-3，5-表异构酶基因并利用定点突变方法将217位EcoRI限制性内切酶位点；667位PstI限制性内切酶位点消除；

改造的草莓GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因FVVTC2：从草莓中克隆GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因并利用定点突变方法将258位SphI限制性内切酶位点；624位HindIII限制性内切酶位点；1070位NdeI限制性内切酶位点；1236位BamHI限制性内切酶位点；1337位PstI限制性内切酶位点消除；

改造的草莓L-半乳糖-1-磷酸酶基因FVVTC4：从草莓中克隆L-半乳糖-1-磷酸酶基因并利用定点突变方法将42位PstI限制性内切酶位点；161位SacI限制性内切酶位点；270位BamHI限制性内切酶位点消除；

改造的草莓L-半乳糖醛酸内酯脱氢酶基因FVGalDH：从草莓中克隆L-半乳糖醛酸内酯脱氢酶基因并利用定点突变方法将678位Nde I限制性内切酶位点消除；

改造的草莓L-半乳糖脱氢酶基因FVGLDH：从草莓克隆L-半乳糖脱氢酶基因并利用定点突变方法将12和263位SacI限制性内切酶位点；340位XhoI限制性内切酶位点；602位EcoRI限制性内切酶位点；611和1625位PstI限制性内切酶位点；1320位BgII限制性内切酶位点；1419位HindIII限制性内切酶位点消除：

改造的草莓脱氢抗坏血酸还原酶基因FVDHAR：从草莓中克隆脱氢抗坏血酸还原酶基因并利用定点突变方法将33位PstI限制性内切酶位点；339位BamHI限制性内切酶位点；453和521位HindIII限制性内切酶位点消除；

步骤2，将所述的表达元件组装到一个原核载体中，构建成维生素C合成表达载体；

步骤3，将所述构建的原核表达载体通过电击转化到大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的利用大肠杆菌从葡萄糖一步合成维生素C方法，其特征在于：所述维生素C合成基因来源于植物。

3.如权利要求1或2所述的利用大肠杆菌从葡萄糖一步合成维生素C方法，其特征在于：所述植物维生素C合成基因全部经过改造，改造方法是，消除野生型基因中常用的限制性内切酶位点；这些位点包括EcoRI、SalI、BamHI、KpnI、XbaI、SacI、BgII、NdeI、SphI、PstI和HindIII。