[发明专利]一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法

说明书

本发明公开了一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法。该方法包括生物柴油副产物的纯化，纯化后甘油的纯度达到63.8％(w/w)；也包括以纯化后甘油为原料制备金合欢烯的重组宿主细胞的构建，该重组宿主细胞包含甲羟戊酸途径或者脱氧木酮糖‑5‑磷酸途径中的相关基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因和金合欢烯合成酶基因，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，所得金合欢烯的浓度为0.025g/L；还包括以纯化后甘油为原料优化构建可提高金合欢烯产量的重组宿主细胞，所得金合欢烯浓度达到2.9g/L，比优化前金合欢烯的浓度提高115倍。

技术领域

本发明描述了一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，包括生物柴油副产物的纯化，也包括以纯化后甘油为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，还包括以纯化后甘油为底物提高产金合欢烯能力的重组宿主细胞的构建并高产金合欢烯。

背景技术

近年来，随着能源紧缺，以及环境的恶化，生物柴油作为一种极有发展前景的生物能源，其规模化发展不断扩大。与此同时，生物柴油副产物也日益增多，远大于传统的生物柴油副产物回收利用的市场需求。因此，对生物柴油生产过程中廉价生物柴油副产物的有效利用成为一个严峻的问题。大力开发和利用生物柴油副产物可以降低生物柴油的制备成本，提高生物柴油的市场竞争力，减少环境污染。其中，通过微生物发酵可以利用生物柴油副产物生产高附加值产品，可以解决生物柴油副产物对环境的污染，是提高生物柴油产业经济效益的途径之一。

第一代生物燃料，特别是乙醇和生物柴油(即脂肪酸甲基酯)受到了很多的限制，如与汽油混合比例的限制，以及在低温条件下较差的表现能力。而金合欢烯，可氢化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料，克服了第一代生物燃料的缺点。金合欢烷具有不含硫和微粒、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的可再生燃料。目前，Amyris公司利用自己的专利菌株将蔗糖(来源于甘蔗)发酵生成金合欢烯。但是，甘蔗属于食品级原料，价格相对昂贵，不利于持续性规模化生产。若能将生物柴油副产物作为原料来发酵生产金合欢烯，将解决原料来源的限制，还能解决生物柴油副产物污染环境的问题，而且可大幅降低生产成本。针对于此，本发明提供了以生物柴油副产物为原料制备金合欢烯的重组宿主细胞及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法(图1)。该方法包括生物柴油副产物的纯化，也包括以纯化后甘油为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，还包括以纯化后甘油为底物提高产金合欢烯能力的重组宿主细胞的构建并高产金合欢烯。

一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，包括步骤如下：

(1)生物柴油副产物的纯化：

a.通过离心除去生物柴油副产物中的不溶性物质；

b.通过蒸馏方法除去生物柴油副产物中的甲醇；

c.通过加入磷酸中和已除去甲醇的生物柴油副产物，离心分离，获得纯化后甘油，用于金合欢烯制备；

(2)以生物柴油副产物为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建：

a.通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成金合欢烯的相关基因，包括甲羟戊酸(MVA)途径或者脱氧木酮糖-5-磷酸(MEP)途径中的基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI)，金合欢烯焦磷酸合成酶基因(ispA)和金合欢烯合成酶基因(FG)；

b.构建多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒，所述的多种重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共同表达合成金合欢烯的相关蛋白；

c.多种重组质粒转化导入宿主细胞中获得合成金合欢烯的重组宿主细胞。