[发明专利]中药材广地龙DNA检测试剂盒及其鉴定方法

说明书

本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种广地龙检测试剂盒及其制备方法。包括基因组提取体系、PCR反应体系及检测体系三部分组成。包括样品前处理，基因组提取，PCR反应及结果鉴定等步骤，地龙的样品前处理分为干样品和湿样品。地龙DNA检测方法是设计地龙基因组特异性寡聚核苷酸引物，人工合成引物，确定反应程序和结果判断等步骤。能够从药用地龙状原料中准确的判断出是否是地龙。鉴定方法简便、快捷，鉴定结果可靠。

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，更具体的说，是一种地龙DNA检测试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

地龙是可以作为药用的蚯蚓，是常用的动物类中药。从我国地龙的药源调查和商品鉴定中发现：我国地龙药材的原动物主要有13个种和变种，分别隶属于钜蚓科、正蚓科和链胃蚓科4个属。除了药典收集记载的品种外，还包括湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、白经环毛蚓等。由于药用地龙的原动物品种较多，目前尚缺乏真实有效的鉴定方法，导致各地市场上出现广地龙药材品种混杂，药材品质优劣参差不齐等问题，严重影响了临床疗效并给服用者留下健康隐患。韦健红在《地龙药材DNA条形码分子鉴定的研究》中采用COI基因序列及16SrRNA基因对广地龙及其他地龙原动物共3个科5个属9个物种的进行了序列比较研究，同时探讨了12SrRNA基因和Cytb基因对地龙原动物分子鉴定的可行性。从中筛选出适用于地龙物种鉴定的DNA条形码。这种方法无疑对于进行学术型的种属鉴定，是适宜的，但就操作性来讲却有失简便。序列对比发现这4个基因在其他类型的地龙甚至其他生物中同源性较高，在使用中除非进行DNA测序，否则很难确定是药用蚯蚓甚至是蚯蚓，而且DNA测序成本高，耗时长。基于此，本发明提供一种更加简便快捷且准确度高的药用广地龙的检测试剂盒及其试用方法。

发明内容

金属硫蛋白是具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质，它普遍存在于生物体内。参环毛蚓在中国习称广地龙，通过序列比对发现参环毛蚓的金属硫蛋白（metallothionein）与其他物种同源性低。本发明基于本蛋白的特异性，提供一种能够在繁杂的地龙药材中准确鉴别广地龙与牛肠、羊肠、鸭肠和鸡肠的特异性，使用方便的地龙试剂盒，并提供其简单、快速、检测结果可靠的鉴定方法。

本发明的目的是由以下技术方案来完成的：具体为一种地龙鉴定试剂盒，包含：

（a）鉴定反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL,0.1mM引物1或引物2中的一种 1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，待检样本1-5μL，用去离子水补齐体系。

（b）阳性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，地龙DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。

（c）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，用去离子水补齐体系。

（d）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，牛、羊、鸡、鸭肠子1:1:1:1混合DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。

本发明的第二个目的在于提供了一种广地龙的鉴定方法，包含如下步骤：

（1）设计广地龙特异性寡聚脱氧二核苷酸引物，含有地龙DNA序列：如下引物1或2中的一种：

引物1

5' GCGAGAAACTCTTTGTGGCG 3'

5' GGAACTGCCGAAAGGCAAAA 3'

引物2