[发明专利]一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法

权利要求书

1.一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：从烟叶醇化库中随机抽取烟叶样品；

步骤二：采用高通量测序技术对烟叶样品中微生物群落多样性与丰度进行分析，获得微生物群落的菌群种类、丰度和空间生态分布信息；

步骤三：进行高通量测序的同时，随机抽取步骤一中得到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；

步骤四：比较步骤二和步骤三的结果，确定步骤三中没有分离出来的微生物种属；

步骤五：对步骤四中所确定的没有分离出来的好氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于设计的分离培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；其中：所述设计的分离培养基为烟叶样品沸水浸提液培养基和寡营养固体培养基；所述烟叶样品沸水浸提液培养基是将15g-25g烟叶样品加入300mL-500mL蒸馏水，煮沸提取25min-45min，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶沸水浸提液，将此浸提液分别按培养基量的5％-15％，25％-35％及45％-55％替换LB培养基的成分所获得的固体培养基，配方如下：5％-15％烟叶水浸提液固体培养基：50mL-150mL烟叶水浸提液；950mL-850mL蒸馏水；胰化蛋白胨9.5g-8.5g；酵母提取物4.75g-4.25g；NaCl 9.5g-8.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；25％-35％烟叶水浸提液固体培养基：250mL-350mL烟叶水浸提液；750mL-650mL蒸馏水；胰化蛋白胨7.5g-6.5g；酵母提取物3.75g-3.25g；NaCl 7.5g-6.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；45％-55％烟叶水浸提液固体培养基：450mL-550mL烟叶水浸提液；550mL-450mL蒸馏水；胰化蛋白胨5.5g-4.5g；酵母提取物2.75g-2.25g；NaCl 5.5g-4.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；所述寡营养固体培养基是将LB培养基成分分别稀释成2倍，5倍及10倍所获得的固体培养基；

步骤六：对步骤四中所确定的没有分离出来的兼性厌氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；所述兼性厌氧微生物分离用培养基为M17固体培养基，Eiller固体培养和MRS固体培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述烟叶样品是在烟叶自然醇化过程中随机取得的烟叶样品。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤三是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL的无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于普通LB固体培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。