[发明专利]一种由大分子量透明质酸获得特定分子量的断链方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种透明质酸断链方法，具体的说是一种由大分子量透明质酸获得特定分子量的断链方法。

背景技术

透明质酸(HA)大分子易发生降解,采用不同方式处理所得的低分子量HA,可能会因为降解部位的不同使其生理功能略有差异。目前,主要有物理法、化学法和酶法三类降解方法。物理法包括超声波法、Y射线辐射法、加热法等。超声波法中，HA溶液在超声处理下能被降解,长链比短链降得快,但很难降到单糖,降解产物的分子量一般会高于10⁴，其缺点为溶液作用不均匀，导致分子量分布较宽。Y射线辐射法中，辐射对粘度的影响较大，虽然辐射后粘度下降很快,但是放置一段时间后粘度有所恢复,可能是由于HA生物大分子经过辐射解聚后又自动聚合所致；而且其需要专人操作，仪器成本较高，难推广。加热法是简单、易于控制的HA降解方法，直接加热处理HA粉末能够降解HA,但是会出现溶液颜色变黄的现象。使用化学降解方法得到的HA产物分子量可以通过改变酸碱度或氧化剂的加入量和反应时间来控制,降解成本较低,易于大规模生产,但氧化降解可能会有氧化剂残留。生物大分子的酶法水解由于其专一性强、反应条件温和并且没有副产物,常被人们首选用于大分子的降解，但是由于透明质酸酶和硫酸软骨素酶的来源非常有限,价格昂贵,在很大程度上限制了它们的应用。我们研究发现1600kDa HA可以用于治疗急性肺损伤。而我们已经获得3000kDa HA，为获得该分子量范围HA我们通过均质机控制压力和循环次数，研究出稳定获得该分子量的方法。

发明内容

为了克服已有透明质酸降解方法的无法使透明质酸断链到特定的分子链。操作复杂、存在溶剂残留、成本较高的不足,本发明提供了一种由大分子量透明质酸获得特定分子量的断链方法，可使透明质酸断链到特定的分子链，操作简单，无溶剂残留，降低成本。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种由大分子量透明质酸获得特定分子量的断链方法，包括以下步骤：

(1)溶解：对已经纯化过的大分子量透明质酸钠用0.9％氯化钠溶液室温搅拌过夜至完全溶解，得到透明质酸溶液，其中透明质酸钠的浓度为0.5～3mg/mL；

(2)断链：将透明质酸溶液置于高压均质机中，控制高压均质机在稳定温度设定循环次数及压力进行断链，所述稳定温度低于60℃；

(3)醇沉：往经步骤(2)处理后的透明质酸溶液中加入2～3倍于透明质酸溶液体积的乙醇，边混边搅拌，过夜；

(4)过滤干燥：将经步骤(3)处理后的透明质酸溶液用四号砂芯漏斗减压过滤，乙醇洗涤；60℃以下真空干燥后获得透明质酸成品。

(5)凝胶色谱制备：将(4)获得的透明质酸成品进一步分段纯化，离心过筛浓缩，真空干燥，获得窄分子量范围透明质酸，用凝胶渗透色谱检测相对分子量和其绝对分子，明确目标分子量。

进一步，所述步骤(1)中，所得溶液中透明质酸钠的浓度优选为1～2mg/mL，浓度过低影响仪器循环次数和压力的选择；浓度过高导致透明质酸粘度过高，增大溶解难度以及操作误差。

进一步，所述步骤(2)中，所述高压均质机要求压力表或数字传感器显示误差不大于1bar；所述步骤(2)的操作是先加溶液再加压，断链结束前先减压防止空转损坏机器；断链时控制均质机内所含溶液量，以防止液体过多或过少导致的压力受力不均；循环次数为2～5次，压力为10～50bar。

本发明的有益效果主要表现在：可使透明质酸断链到特定的分子链，操作简单，无溶剂残留，降低成本，且可重复性强。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。

一种由大分子量透明质酸获得特定分子量的断链方法，包括以下步骤：

(1)溶解：对已经纯化过的大分子量透明质酸钠用0.9％氯化钠溶液室温搅拌过夜至完全溶解，得到透明质酸溶液，其中透明质酸钠的浓度为0.5～3mg/mL；

(2)断链：将透明质酸溶液置于高压均质机中，控制高压均质机在稳定温度(低于60℃)设定循环次数及压力进行断链；

(3)醇沉：往经步骤(2)处理后的透明质酸溶液中加入2～3倍于透明质酸溶液体积的乙醇，边混边搅拌，过夜；

(4)过滤干燥：将经步骤(3)处理后的透明质酸溶液用四号砂芯漏斗减压过滤，乙醇洗涤；60℃以下真空干燥后获得透明质酸成品。

(5)凝胶色谱制备：将(4)获得的透明质酸成品进一步分段纯化，离心过筛浓缩，真空干燥，获得窄分子量范围透明质酸，用凝胶渗透色谱检测相对分子量和其绝对分子，明确目标分子量。