[发明专利]一种抗家禽IgYFc片段的单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物分子生物学、免疫学技术应用领域，具体涉及一种抗家禽IgY Fc片段的单克隆抗体及应用。

背景技术

IgY(immunoglobulin of yolk)是存在于鸟类、爬行类和两栖类动物中的、功能与IgG相当的一种免疫球蛋白，其中以禽类IgY研究最多。1893年Klemperer等首次阐明了鸡的被动免疫，指出母源特异性抗体通过蛋黄转移的途径实现对新生鸡的保护作用。1969年Le slie和Clem将存在于禽类及卵黄中的抗体正式命名为IgY。然而这一发现并没有获得重视，一直到二十世纪八十年代，关于IgY的特异性和研究成果才随着商品试剂的广泛使用而受到关注从而被广泛应用。

IgY有2条重链和2条轻链，此结构与哺乳动物的免疫球蛋白IgG类似。完整型的IgY分子轻链包括1个可变区(V区)和1个恒定区(C区)，V区是用以识别抗原和决定抗体特异性的部位，而C区氨基酸的数目和顺序则相对恒定。重链包括1个可变区和4个恒定区(CH1、CH2、CH3、CH4)。完整型IgY分子的CH3和CH4区域与IgG的CH2和CH3具有一定的同源性，完整型IgY分子量约为180KDa，其沉降系数为7.8s，重链62～67KDa，轻链22～25KDa。

已有研究报道纯化了鸡、鹅、鸵鸟等19种鸟类的IgY，并制备了相应的兔抗禽类IgY的IgG抗体(杨帆，19种抗禽类IgY多克隆抗体的制备和标记)。另外，本实验室曾制备了小鼠抗鸡IgY Fc单克隆抗体，具有良好的特异性和敏感性，并应用于鸡的主要传染病的免疫抗体水平检测或疾病的快速诊断，已申报获批了4项国家发明专利(一种单克隆抗体，包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200510011521.8；鸡新城疫抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200710169103.0；一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用，专利授权号ZL200710051442.9；鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒及应用，专利授权号ZL200710169106.4)，但上述多克隆抗体或本实验室曾研制的小鼠抗鸡IgY Fc单克隆抗体均只是针对单一禽类IgY的抗体，无法实现对多种禽类IgY的检测，因此使其应用具有较大的局限性。

本发明目的在于通过扩增特异性鸭IgY Fc CH3CH4基因片段，获得纯化的原核表达重组蛋白，应用杂交瘤单克隆抗体技术，制备一种既可检测鸭IgY也可检测其他禽类如鸡、鹅、鸽、鸵鸟等IgY的单克隆抗体。通过ELISA和Western blot方法进行检测，结果表明所制备的小鼠抗家禽IgY Fc片段的单克隆抗体不仅可与鸭血清反应，还可与鸡、鹅、鸽和鸵鸟等禽类血清发生阳性反应，而与猪、兔和牛等哺乳动物血清不反应。说明所制备的抗家禽IgY Fc片段单克隆抗体可作为一种抗禽类IgY的通用抗体试剂，既可以用于相关领域的科学研究中，又可用于ELISA和胶体金免疫层析技术等，研制检测禽类传染病抗体的ELISA或者胶体金试纸条等试剂盒。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株LZLPH Z，保藏编号为：CCTCC NO：C2015188。

本发明的第二个目的是获得一种特异性强的抗家禽IgY Fc的单克隆抗体。

本发明最后一个目的在于提供了杂交瘤细胞株LZLPHZ或其分泌的单克隆抗体在制备家禽传染病抗体检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明以纯化后的重组蛋白GST-CH3CH4作为免疫原免疫5～8周龄的Balb/c小鼠，通过杂交瘤筛选出阳性杂交瘤细胞，连续克隆化3次以上，直至所有被检孔均呈阳性反应，才完成该杂交瘤细胞的建株工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤子细胞系LZLPHZ已于2015年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株LZLPHZ，CCTCC NO：C2015188，地址：中国武汉武汉大学。

该细胞系的染色体计数结果显示，SP2/0的染色体数为70条，小鼠脾细胞为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间，高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。该细胞在含20％新生牛血清的RPMI-1640培养基中生长良好。

一种抗家禽IgY Fc的单克隆抗体，该单克隆抗体通过杂交瘤细胞株LZLPHZ(CCTCC NO：C2015188)分泌获得。