[发明专利]利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法

说明书

本发明提供一种利用CRISPR‑CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。根据大鼠Slc22a2基因序列，构建基于CRISPER‑Cas9系统的gRNA表达载体，以此作为Slc22a2基因打靶载体，转入NRK细胞中，获得Slc22a2基因敲除的NRK细胞，其可作为理想的细胞模型，模拟人体肾脏环境中OCT2蛋白的缺失，用于研究OCT2蛋白在药物、毒素以及其他小分子物质转运方面的应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。

背景技术

NRK-52E细胞是大鼠肾小管上皮细胞，很多药物、毒素的分泌、吸收都在肾小管上皮细胞完成。在肾脏中有很多转运蛋白在药物、毒素的分泌、吸收中发挥着重要作用。有机阳离子转运蛋白家族(OCTs)是跨膜蛋白，包括三个亚型1-3，由SLC22A1-3编码，转运有机阳离子、弱碱和一些中性化合物。人OCT1主要在肝脏表达，将血液中的有机阳离子转运进肝脏，然后再进行生物转化。OCT2主要分布于肾脏和脑部，参与药物、毒素肾清除和脑转运。OCT3在多种组织中都有表达，例如肾、肝、小肠、脑、骨骼肌、胎盘等，负责中枢神经系统中内源物质的转运。

在该家族成员中，OCT2(基因Slc22a2)在人肾近端小管细胞基底膜表达丰富，所以有可能他们在近端小管从血液吸收化合物的过程中起重要作用。人OCT2和大鼠OCT2均位于肾近端小管基底膜，参与许多化合物肾排泄和肾重吸收。人OCT2转运四乙胺、1-甲基-4-苯基吡啶、4-[4-(二甲氨基)苯乙烯基]-N-甲基吡啶、N-甲基烟酰胺、氨基胍。OCT2还转运神经递质，例如乙酰胆碱、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、组胺、胆碱。人OCT2也转运黄曲霉毒素B1、百草枯、溴化乙锭。一些蛋白参与了OCT2的转录后调控，如蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、钙调蛋白。OCT2介导许多药物肾外排的第一步，以及胆碱或其他有机阳离子底物在近端小管重吸收的第二步。人中枢神经系统中的OCT2能将药物转运通过血脑屏障，例如抗帕金森的药物。在急性和慢性肾损伤中，肾OCT2蛋白表达下降，会导致OCT2底物的药代动力学和肾毒性的改变。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。

本发明的另一目的是提供利用上述方法制备的Slc22a2基因敲除的NRK细胞系及以其作为细胞模型在研究OCT2蛋白的转运功能中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种Slc22a2基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，gRNA作用位点位于大鼠Slc22a2基因的2号外显子上，gRNA作用位点的DNA序列为5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′(SEQ ID NO:1)。

用于构建所述表达载体的出发载体为pX458。

所述表达载体其是将gRNA作用位点的DNA序列5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，构建得到的。

本发明还提供所述打靶载体在制备Slc22a2基因敲除的NRK细胞系中的应用。

本发明还提供一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法，其是根据大鼠Slc22a2基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体，以此作为Slc22a2基因打靶载体，转入NRK细胞中，获得Slc22a2基因敲除的NRK细胞。

其中，gRNA作用位点位于大鼠Slc22a2基因的2号外显子上，gRNA作用位点的DNA序列为5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′。