[发明专利]一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株，和其粗提产物的杀虫效果。

背景技术

在与环境相互作用过程中，丝状真菌形成了独特的应对环境胁迫机制。其中，合成真菌毒素抵御敌害生物的吞食是其重要的生存策略之一。大多数丝状真菌在昆虫吞食时合成诱导性毒素。有些丝状真菌如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)等在正常生理条件下合成组成性毒素。粗糙脉孢菌基因组中含有6个聚酮类合成酶基因(polyketide synthase gene,pks)。前期研究发现pks-6基因的敲除菌株极易遭致跳虫的吞食。利用乙酸乙酯分别提取pks-6基因的敲除菌株和pks-6基因高表达菌株的代谢产物，并给大蜡螟注射相同剂量的后发现：在培养的第12天，pks-6基因的敲除菌株代谢产物导致的大蜡螟的死亡率为68％，pks-6基因高表达菌株的代谢产物导致大蜡螟的死亡率为100％，由上可见pks-6基因的产物呋喃香豆素(neurosporin A)具有杀虫效果。但是，呋喃香豆素在野生型粗糙脉孢菌中的积累水平较低，模式真菌构巢曲霉生长速度较快，遗传背景清晰，且次级代谢产物积累量较多。

发明内容

为了解决上述问题，本发明是利用同源重组的原理，将粗糙脉孢菌pks-6基因在遗传改造后的构巢曲霉中进行异源表达，获得了一株高产呋喃香豆素的重组菌株，并且该菌株的乙酸乙酯粗提取产物具有较强的杀虫效果。

本发明的第一个目的在于提供一种可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株；

本发明的第二个目的在于提供利用上述重组菌的构建方法；

本发明的第三个目的在于提供一种该菌株的乙酸乙酯粗提物用于杀虫的用途。

为了实现上述目的，本发明首先提供一种pks-6重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks6，其特征在于，所述重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明提供一种包含重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的重组菌株。

另一方面，本发明提供一种重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转化的宿主细胞。

另一方面，重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转化的宿主细胞是构巢曲霉L08030。

另一方面，本发明提供一种重组载体pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接。

另一方面，本发明提供一种pks-6构巢曲霉重组菌株的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接；利用原生质体转化的方法将pYH-WA-PyrG-KI-pks6转入构巢曲霉L08030中，利用不含PyrG的培养基筛选重组菌株，并利用PCR进行验证。

另一方面，本发明提供一种含有pks-6基因重组构巢曲霉L08030的粗提产物的杀虫剂。所述的提取溶剂为乙酸乙酯。

另一方面，本发明提供一种杀虫剂用于杀灭昆虫的应用，所述昆虫为大蜡螟、果蝇。

发明详述：

(1)重组菌株的构建

以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接。利用原生质体转化的方法将pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转入构巢曲霉L08030中，利用不含PyrG的培养基筛选重组菌株，并利用PCR进行验证。

(2)重组菌株的大量培养

将大米和自来水的比例以1：1混合均匀后，放入灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌。待冷却后，加入重组菌株的液体培养物，并利用无菌的玻璃棒搅拌均匀，置于温度为30℃，相对湿度为50％的培养箱中进行培养14天。

(3)对果蝇毒性的影响

利用乙酸乙酯分别提取构巢曲霉L08030和pks-6基因重组菌株代谢产物，利用旋转蒸发仪挥干溶剂后，加入DMSO溶解代谢产物。将上述溶液加入熔化后且温度降至45℃的果蝇培养基中。待培养基凝固冷却后，每组接种50条果蝇幼虫，以仅加入DMSO的培养基作为对照组。观察并记录果蝇的生长发育情况。

(4)对大蜡螟毒性的影响