[发明专利]一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用

说明书

本发明主要提供了一种在酵母中高效表达抗菌肽的方法。本发明所提供的方法包括将抗菌肽与一种红色荧光蛋白进行融合表达，在重组酵母中可以通过肉眼可见的颜色深浅判断菌株中抗菌肽产量的高低，以此快速筛选出高表达抗菌肽并具强抑菌活性的工程菌株。本发明还提供了一种具抑菌活性的重组融合蛋白和工程重组菌，所述重组蛋白和重组菌可直接应用于工业或饲料行业。

技术领域

本发明属于基团工程领域，具体地，本发明涉及一种可视化抗菌肽融合蛋白及其制备方法和其应用。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides)是一般由12～50个氨基酸残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸)的两性小分子多肽。在动物、植物和微生物中广泛存在，是宿主免疫防御系统的重要组成部分，其抗菌谱宽、免疫原性低，而且不易产生耐药性的特点及有抑制癌细胞生长的作用，这使得抗菌肽开发利用成为近年来的研究热点。但抗菌肽的开发利用并非易事，抗菌肽天然资源有限，提取非常复杂；化学合成，不但成本很高，还对环境造成严重污染。因此迫切需要一种廉价安全的生产技术来生产抗菌肽。基因工程生产方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法。

目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接从发酵液中分离抗菌肽，相比大肠杆菌表达体系更易于大规模工业化生产。但是，由于抗菌肽是小分子含有多个碱性氨基酸的碱性多肽，极易受到蛋白酶的攻击。同时表达的产物往往对宿主细胞有毒性，会直接抑制宿主菌的生长，影响表达效率。因此抗菌肽的外源表达较其它多肽类药物更为困难。另外，筛选抗菌肽的高效表达工程菌时，通常采用抗菌肽有特殊的抗菌活性，通过抑菌实验筛选，那么每次就要对成千上万的转化子进行鉴定，先对每个转化子进行初步筛选，利用抗菌筛选抗菌活性相对较高的工程菌，再来进行复筛，这样要消耗大量的人力和物力。因此，如何解决抗菌肽免受蛋白酶的攻击，减少其对宿主细胞的毒害，以及如何筛选高效表达抗菌肽的酵母工程菌成为了抗菌肽事业发展的瓶颈。

发明内容

本发明提供了一种重组融合蛋白His-mApple-DP-AP，所述蛋白包括如下1)或2)所述的蛋白：

1)具有序列表中的SEQ ID №.7所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.7的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有抗菌肽活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.7所示的氨基酸序列由262个氨基酸残基组成。

上述1)或2)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行重组异源表达得到。上述1)或2)所述的蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.7所示DNA序列缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明还提供了一种编码基因，所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)编码本发明所述蛋白的多核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；

5)序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；

6)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；