[发明专利]鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及piRNA在其中的应用

说明书

本发明涉及piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用；还涉及一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。将所述piRNA作为分子标志物，通过检测其表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro‑TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，还涉及用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。

背景技术

不孕不育是一类常见的生殖疾病，在育龄夫妇中的发病率约为15％。男性不育症中，最严重的一类是无精子症，约占育龄男性人口的1％。在所有导致男性的不育病因中，精子发生障碍是最为常见的因素，也是成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子发生障碍是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义的无精子症为：三次精液常规分析，显微镜检查精液标本未见精子，经3000g离心15min，仍无精子)。其中非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)约占无精子症的60％，梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia,OA)约占40％。

piRNA是一类小分子非编码单链RNA，长约24-32个核苷酸，于2006年在小鼠睾丸内发现并分离出来，因其能与Piwi蛋白家族成员结合发生相互作用，故称为Piwiinteracting RNAs，简称piRNAs。piRNA来源于单链RNA前体，普遍分布在整个基因组上，但具有高度的不连续性,5′端多具有尿嘧啶偏向性、多分布于动物生殖细胞和胚胎干细胞内,多数位于基因间隔区,少数分布在基因内含子和外显子中的特点。piRNA的生物功能多种多样,主要体现在沉默转座子、阻碍转录翻译、调节生育能力和影响遗传信息传递等方面。新近的一些研究发现，人精浆中存在多种piRNA，精浆piRNA主要是以游离于微囊泡之外的形式存在，游离的精浆piRNA与蛋白结合维持着精浆信使RNA(mRNA)的稳定性,而精浆piRNA表达谱的改变则有助于了解男性不育症的病理过程和可能的发病机制。

有研究发现，大约30～40％NOA患者睾丸组织中还残存有少量的“局灶性”精子发生，可以找到少量睾丸内残存精子，并借助于辅助生殖技术生育自己的遗传学后代。因此，目前对于NOA的处理方法主要是通过外科睾丸显微取精术(micro-dissection testicularsperm extraction,micro-TESE)配合辅助生殖技术(assisted reproductivetechnology，ART)来达到生育自己遗传学后代的目的。

然而，迄今报道的micro-TESE获取精子成功率大约只有40％左右，其原因在于，大部分NOA患者的睾丸生精小管中没有精子。micro-TESE手术需要切开睾丸并分离睾丸组织查找极为少量的具有一定精子发生能力的生精小管，对睾丸组织的创伤相对较大，可能破坏睾丸的血供，甚至形成瘢痕粘连，严重时甚至可能导致术后睾丸萎缩。对于没有睾丸内残存精子的NOA患者而言，进行micro-TESE手术显然不利于患者的身体健康。

然而，迄今尚无手术前预判睾丸内残存精子的非损伤性检测指标，也没有使用piRNA作为NOA患者睾丸内残存精子的预判指标的任何报道。

由于大部分NOA的病因尚不清楚，还缺乏有效的治疗手段。大多数NOA病人只能盲目选择micro-TESE和辅助生殖技术，这会给大部分病人造成不必要的身体上的伤害、心理上和经济上的负担。能否术前预判NOA患者睾丸睾丸内残存精子是本领域亟待解决的问题，也是精准医疗的发展方向。

因此，需要找到非损伤性、高灵敏性以及高特异性的生物学标志物，这些新的标志物及其指标变化可以作为NOA患者micro-TESE能否找到精子的预判指标。

发明内容