[发明专利]敲除p53基因在抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移中的应用

说明书

本发明属于肿瘤细胞技术领域，具体涉及一种敲除p53基因在抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移中的应用。本发明的技术方案是通过敲除P53基因，使人恶性神经胶质瘤细胞P53基因发生改变，从而使p53蛋白表达降低甚至完全缺失，从而达到抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移的目的。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞技术领域，具体涉及一种敲除p53基因在抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移中的应用。

背景技术

神经胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，约占中枢神经系统原发肿瘤的40％～50％。世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类中将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅲ和Ⅳ级为恶性胶质瘤，占所有胶质瘤的77.5％。半数以上的神经胶质瘤是多形性胶质母细胞瘤，这是一种恶性程度为IV级的星形胶质瘤。患有多形性胶质母细胞瘤的病人，1年生存率约为13％，中位生存时间仅为1年。多形性胶质母细胞瘤预后差的主要原因在于其高复发率及化疗高抵抗性。尽管联合神经外科手术，化疗和放疗的手段，目前都无法较好的延长病人的寿命。而恶性神经胶质瘤的致命性表现在它的指数增长和浸润性。如果能使肿瘤细胞维持在非增殖(或低增殖)状态，降低其浸润性，这对于神经胶质瘤的治疗也许也是一种可行的辅助策略。

p53是公认的肿瘤抑制基因，它主要参与细胞周期G1/S的检控点调控，DNA损伤修复和细胞衰老等过程。然而近年来p53的新作用被不断发现，研究显示p53的缺失有利于神经干细胞的自我更新，不阻碍神经干细胞向终末神经细胞的分化，反而可能有加速其分化的作用。也有研究显示，p53的缺失在诱导多能干细胞的自我更新和分化潜能的获得方面起促进作用。我们之前的一些研究发现，p53的缺失可以改变人成纤维细胞的自我更新能力或分化潜能，使人成纤维细胞转分化成终末神经元细胞并退出细胞周期。而p53在神经领域的的其他功能也还在被陆续发现中。

基因编辑是指定点改造基因组，对目标基因进行编辑，实现对特定的DNA序列进行敲除、插入、定点突变和组合编辑等。过去几年中，以锌指核糖核酸酶(zinc-fingernucleases, ZFNs)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcriptional activator-likeeffector nuclease, TALEN)为代表的核酸酶技术，在基础研究、基因工程等领域都取得了成功的应用。 CRISPR/Cas9作为里程碑式的基因编辑技术，是以RNA作为基因组定位工具，而无论ZFN 还是TALEN，都是以特异性DNA结合位点蛋白作为基因组定位工具，众所周知，合成 RNA要比合成蛋白质简单得多。所以与TALEN和ZFN相比，CRISPR/Cas9不仅成本低、方法简便、而且更加快捷高效。因此，以CRISPR/Cas9系统完成p53基因的敲除，是优先的选择。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种敲除p53基因在抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移中的应用，目的是通过敲除P53基因，使人恶性神经胶质瘤细胞P53基因发生改变，从而使p53蛋白表达降低甚至完全缺失，从而达到抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移的目的。

本发明的敲除p53基因在抑制神经胶质瘤细胞增殖和转移中的应用，具体步骤是：

1.敲除人神经胶质瘤细胞的p53基因；

2.敲除p53基因的人神经胶质瘤细胞增殖减慢，且细胞浸润性降低。

其中，所述的.敲除人神经胶质瘤细胞的p53基因采用的方法是CRISPR/CAS9法、ZFNs 或TALEN法。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

p53是公认的抑癌基因，以往的应用策略都是外源添加野生型p53蛋白以期望对肿瘤的生长起抑制作用，但效果并不理想。可能是由于有些胶质瘤中p53蛋白发生突变后，使得p53蛋白不能降解，反而阻碍细胞周期的正常运转所致。我们在研究中也发现，p53被敲除后，胶质瘤细胞并没有明显影响其下游经典的p21通路，而是显著影响了神经元转录因子NeuroD2的表达。这可能是敲除p53后，神经胶质瘤细胞生长得到抑制的机制。