[发明专利]一种应答3-脱氢莽草酸的生物传感器及其应用

说明书

利用基因工程或代谢工程等手段构建生产3‑脱氢莽草酸(3‑dehydroshikimate,DHS)的菌株已获得成功，但快速获得高效稳产的菌株成为利用生物手段规模化生产3‑脱氢莽草酸的最大瓶颈。本发明用调控基因cusR和/或调控基因cusR的启动子以及报告基因组成生物传感器，实现对3‑脱氢莽草酸浓度正相关应答，解决了3‑脱氢莽草酸化合物本身无色，且缺少有效的显色反应从而难以实现高通量筛选的技术瓶颈，进一步的开发出一种产3‑脱氢莽草酸菌株突变库筛选方法。

技术领域

本发明涉及生物传感器及生物技术领域，尤其涉及新型3-脱氢莽草酸应答功能生物传感器、包含该生物传感器的转录表达系统以及包含该生物传感器的高通量筛选系统。

背景技术

3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate,DHS)是植物和微生物生存所必需的中间代谢产物，经进一步加工可形成高附加值产品，是一种重要的药物及精细化学品原料。传统采用化学方法进行合成，由于其合成原料用到苯或甲苯，往往对人体和环境造成危害。近年来，利用基因工程或代谢工程等手段生产3-脱氢莽草酸获得成功，但快速获得高效稳产的菌株成为利用生物手段规模化生产3-脱氢莽草酸的最大瓶颈，其原因在于：3-脱氢莽草酸化合物本身无色，且缺少有效的显色反应，目前，筛选3-脱氢莽草酸高效稳产细胞主要基于HPLC或质谱，检测速度慢，检测量每天仅数千个候选菌。因此，寻找高通量细胞筛选方法成为利用高效菌株规模划化生产3-脱氢莽草酸的重要途径。

近年来，采用能够应答小分子代谢物的生物传感器，并结合报告基因构建生物传感器，实现小分子代谢物含量及其表达细胞的快速检测已经获得巨大成功。已有通过代谢物小分子应答基因构建生物传感器用于相应工程菌株筛选以及通过代谢物小分子应答基因可控表达目的基因的案例，包括相应生物传感器应用于缬氨酸、亮氨酸、苯甲酸酯等多种小分子菌株突变库筛选工作，但是，目前还没有正相关应答3-脱氢莽草酸基因的报道。

Munson和Gudipart等分别研究证实：调控基因cusR为胞质内铜离子感应调控因子，其与编码膜结合感应组氨酸激酶的基因cusS共同组成cusSR双元件系统，该cusSR双元件系统将调控激活位于该双元件系统相反方向操纵子cusCFBA的表达，该操纵子的基因cusB和cusA预测编码跨膜蛋白，cusA编码的膜蛋白形成双通道泵的结构用以排除胞内过多的铜离子，而基因cusC预测为膜外蛋白，起到感应铜离子浓度作用。综上，操纵子cusCFBA的作用在于排除胞内铜离子，使细胞免受过高铜离子带来的危害。但已公开的信息中从未报道cusR与3-脱氢莽草酸的一定正相关应答特性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应答3-脱氢莽草酸的生物传感器，并利用该生物传感器构建应答3-脱氢莽草酸浓度生物传感器，进而构建一种高产3-脱氢莽草酸细胞的筛选方法。

一种应答3-脱氢莽草酸的生物传感器，所述生物传感器包括调控基因cusR和/或调控基因cusR的启动子组成的传感器核心元件。

本发明中调控基因cusR的核苷酸序列为下述的任意一种：

1)SEQ IDNO：1所示的多核苷酸；

2)SEQ IDNO：1所示序列的同源性≥80％，(较佳的≥95％)，且其表达强度表现出与3-脱氢莽草酸浓度应答正相关性。

3)与1)-2)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明中调控基因cusR的启动子的核苷酸序列为下述的任意一种：

1)SEQ IDNO：2所示的多核苷酸；

2)SEQ IDNO：2所示序列的同源性≥80％，(较佳的≥95％)，且其能控制cusR基因转录。

3)与1)-2)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明中所述的生物传感器用于构建应答3-脱氢莽草酸的生物传感器；