[发明专利]制备神经干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种制备神经干细胞的方法。

背景技术

神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。根据分化潜能的时序分为：主要存在胚胎时期的神经管上皮细胞、放射状胶质神经元和神经母细胞，其中，放射状胶质神经元主要存在于幼年时期，可以分裂并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞；神经母细胞主要存在于成年动物体中，可以产生神经前体细胞、神经元和各类神经胶质细胞。根据部位主要分两类：神经嵴干细胞和中枢神经干细胞。目前将具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞都统称为神经干细胞。

在神经系统疾病的治疗方面，除了传统的药物、手术及康复治疗外 ，近年来细胞移植治疗神经系统疾病研究得到了广泛开展，主要包括骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞与神经干细胞移植等。2009年，研究者成功的将人胚胎干细胞注射到脊髓损伤的大鼠体内，从而使大鼠恢复了运动能力，但直接注射胚脂干细胞存在形成肿瘤的风险，经过大量实验证明，利用神经干细胞进行细胞移植治疗神经系统疾病是有效且安全的选择，神经干细胞不具有成瘤性，具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能；是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，具有低免疫源性；其组织融合性好，可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活，是最理想的细胞移植材料。因此，业内一直致力于神经干细胞的临床应用研究。

神经干细胞可以由胚胎干细胞、诱导多能干细胞和其它干细胞分化而来。胚胎干细胞是从哺乳动物的囊胚内细胞群和原始的生殖细胞着床前胚胎内细胞团中分离出来的一种全能性的多功能神经干细胞，这种细胞可以在体外进行扩增培养，因此，提供无致瘤性、且能够在体外快速增殖、稳定传代、大量培养神经干细胞成为目前的当务之急。

神经干细胞的体外培养一直是一个比较困难的课题，其难点在于两点，一是所需试剂和因子的浓度配比需要摸索，花费了大量的时间和精力才能达到最佳的配方；二是传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的。这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殪缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞。因此这使得相关的科研工作者很难得到大量的神经干细胞来进行相关的研究工作。 为解决传统的神经干细胞体外培养是通过悬浮培养神经球，观察神经球数量倍增后，通过离心，扩瓶培养达到传代的目的，这种悬浮培养的方法，神经干细胞增殖缓慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很难收获大量的神经干细胞等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备神经干细胞的方法。

为达到上述目的，本发明制备神经干细胞的方法，包括如下步骤：

l、在无菌条件取得脑神经组织放入神经组织保存液中，并在4～12。C的温度条件下密封保存；

2、将步骤 l中的神经组织从神经组织保存滚中取出，并使用神经组织洗涤液漂洗；

3、将步骤 2中漂洗后的神经组织切成碎块，并加入2-3倍体积的神经组织分解液，同时放入35～40。C的二氧化碳培养箱中消化分解45～60分钟，每隔3～5分钟取出震荡一次；

4、向步骤 3中消化分解后的液体中加入继代细胞培养液，均匀混合后，混合液通过200目的细胞筛，收集过滤液，并使过滤液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，其中，继代细胞培养液是神经组织分解液体积的2倍；

5、离心后的过滤液去掉上清液，加入原代细胞培养液，使溶液中的细胞浓度为2×105个／毫升，并保持溶液中细胞悬浮培养，培养后即得到PO代神经干细胞。

进一步的，利用步骤 5中培养得到的PO代神经干细胞继续传代培养的方法包括以下步骤：

(1) Pl代神经干细胞的悬浮培养：①继续培养PO代神经干细胞，当PO代神经干细胞聚集成球后，将其在1500转／分钟的条件下离心8分钟；②离心后的培养液去掉上清液，加入继代细胞培养液，并使培养液中的细胞浓度为1×105个／毫升，接种培养后即得到Pl代神经干细胞；