[发明专利]酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了酶学性能改善的甲基对硫磷水解酶突变体及其应用。本发明对野生型甲基对硫磷水解酶进行定点改造，结合蛋白结构计算、模拟技术和分子生物学技术对OPHC2进行体外突变和表达，并运用生物化学手段检测蛋白酶的动力学参数和稳定性，筛选获得热稳定性和底物亲和力有显著改善的突变体V117HQ119E以及催化效率显著提高并在表面活性剂中稳定性提高的突变体F263W，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。本发明显著改善了OPHC2的酶学性能，拓宽了OPHC2的应用领域和作用效率，在有机磷农药降解、机体解毒和神经毒剂洗消等方面应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及有机磷降解酶的突变体，尤其涉及催化性或稳定性提高的甲基对硫磷水解酶突变体，本发明进一步涉及编码甲基对硫磷降解酶突变体的基因，属于有机磷降解酶突变体及其应用领域。

背景技术

有机磷化合物在农药、神经毒剂、阻燃剂等领域应用广泛，它们的特点是致毒力强，破坏性大，难降解，给人类和社会带来了巨大的安全隐患(Bajgar,J.,Complex view onpoisoning with nerve agents and organophosphates.Acta Medical,2005.48(1):p.3-21.)，发展高效环保的有机磷降解体系是近几十年的研究热点之一(Balali-Mood.,M.andH.Saber,Recent advances in the treatment of organophosphorouspoisonings.Iranian Journal of Basic Medical Sciences,2013.37(2):p.74-91；周斌.,et al.,有机磷农药生物降解技术研究进展.化工学报,2005.25(5):p.353-357；Jokanovic,M.,Current understanding of the mechanisms involved in metabolicdetoxification of warfare nerve agents.Toxicol Lett,2009.188(1):p.1-10；Kassa,J.,et al.,The present approaches to the development of prophylactic andtherapeutic antidotes against nerve agents.Interdisciplinary Toxicology,2008.1(1).)。与传统的化学降解法相比，酶基降解具有明显的优势，高效、安全、无污染，无残留，因此引进有机磷水解酶消除含磷化合物的危害作用具有重要的意义。

有机磷降解酶(Organophosphorus hydrolase，EC3.1.8.1)是一种可以水解磷酯键的酶。一方面，它可以断裂有机磷农药的磷酯键使其脱毒；另一方面，由于不同种类有机磷农药的区别大都是取代基不同，所以一种有机磷降解酶往往可水解多种有机磷农药。其中，甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase，MPH)的最适底物是甲基对硫磷，酶分子结构解析和进化树分析结果表明它属于β内酰胺酶家族(PFAM accessionno.PF00753)。