[发明专利]一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因鉴定方法技术领域，具体的说是涉及一种采用ddPCR鉴定 PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法。

背景技术

PML-RARα融合基因由t(15:17)(q22:q21)易位形成，常见于急性早幼粒细胞白血病(APL)。RARα和PML的fusion具有以下特征：RARα基因断裂位点位于第二内含子；而PML基因有三个区域参与了t(15：17)易位，即内含子6(Brc1，约占55％)、外显子6(brc2，约占5％)、内含子3(brc3，约占40％)。PML-RAR α融合基因根据断裂位点的位置可分为三种亚型：如图1所示,长型(L型、Brc1)、变异型(V型、brc2)和短型(S型、brc3)。目前白血病的治疗较有效，其病人生存期得到了延长，但后期跟进发现数年内复发率较高，可能原因为目前采用RT-PCR检测技术其检测灵敏度仅为0.1％。基于该检测技术的局限性，本项目采用更加高灵敏的ddPCR方法进行检测，旨在对临床具有指导意义，其灵敏度可达0.01％。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种具有高灵敏度的采用ddPCR 鉴定PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种采用ddPCR鉴定PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法，该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，具体操作过程如下：(1)提取RNA：将血浆分装在1.5ml EP管中，每管分装300μl； (2)使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μl CL 至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；(3)加入150μl buffer PKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；勿配置mix，需单独依次加入； (4)样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；(5) 13400rpm离心15min，转移上清160μl至1.5ml EP管中；(6)将上清置于恒温仪上80℃孵育15min，13400rpm快速离心30s；(7)加入320μl buffer RLT，吹打混匀，再加入1000μl 96～100％乙醇，涡旋混匀；(8)每次转移700μl样本至RNeasy MinElute离心柱中，13400rpm离心15s，弃滤液，重复本步骤直到将所有样本过柱完毕；(9)加350μl buffer FRN到离心柱，13400rpm离心 15s，弃滤液；(10)配mix:10μl DNaseI和70μl buffer RDD，吹打混匀，将其加到离心柱中的膜上，置于室温20～30℃温度下15min；(11)加500μl buffer FRN至离心柱，13400rpm离心15s，保留滤液；换一个新的2ml收集管，将滤液重新加入到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；(12)加入500μl buffer RPE至离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液，重复一次；(13)将离心柱置于新的2ml收集管中，管盖打开，13400rpm离心5min；(14)将离心柱置于新的1.5ml EP管中，加入25μl RNase-free water至离心柱中央的滤膜上，闭合管盖，室温15～25℃温度下静置1min；13400rpm离心1min；(15)提取的RNA立即进行反转录或冻存于-80℃；(16)RNA QC评估：使用Nanodrop对RNA进行定量并参考A260/280数据，或者使用labchip/2100进行RNA质量评估，评估RIN值；

该方法还包括RNA反转录cDNA并进行QC评估，具体操作过程如下：

(1)RNA反转录cDNA，反转录引物与模板RNA结合，待PCR程序结束后，放置于冰上，不少于1min；HELA作为control只需投入1ul，即10ng即可。

(2)准备RT反应混合液及进行RT孵育：将7ul mix加入至上一步的13ul 中，吹打混匀，反应总体系20ul，在PCR上进行反转录反应，反应完成后存放至-20℃保存。

(3)cDNA QC评估：采用试剂盒自带的HELA control primer，进行PCR反应，跑胶验证条带，质控反转录反应的完成情况。

ddPCR体系：

ddPCR程序：