[发明专利]线粒体耳聋A1555G突变的荧光定量PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种线粒体耳聋A1555G突变的荧光定量PCR检测试剂盒，及其在线粒体耳聋A1555G突变检测中的应用。

背景技术

耳聋是全球关注的公共卫生问题，由遗传和环境因素共同作用引起，其中超过50％的耳聋患者由遗传因素导致。在遗传性耳聋中，30％为综合征耳聋，70％为非综合征耳聋。耳聋的遗传方式可表现常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传和母系遗传，线粒体DNA(mtDNA)突变是母系遗传性耳聋发生的重要原因之一，在遗传性耳聋中的发病率约为1％～2％。

位于mtDNA 12S rRNA上的A1555G突变是氨基糖苷类抗生素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等的作用靶点，与药物性耳聋的发生密切相关。该突变的主要致聋机制是人类mtDNA的第1555位核苷酸相当于细菌16S rRNA的第1491位核苷酸，当发生A1555G突变时，mtDNA 12S rRNA的A区能形成一个新的碱基配对，导致12S rRNA的二级结构与细菌16S rRNA对应部位的相似度更高，从而促进氨基糖苷类抗生素与之结合，结合后的氨基糖苷类抗生素会抑制参与氧化磷酸化过程的呼吸链蛋白的合成，使携带该突变的个体发生听力损伤。总之，携带A1555G突变的个体对氨基糖苷类药物具有超敏性，可引起临床上常见的“一针致聋”现象，是药物性耳聋发生的重要原因之一。

目前，mtDNA突变的常见检测方法主要有直接测序法、微阵列芯片法、PCR-RFLP法、荧光定量PCR法等。直接测序法的优点是准确性高，但检测周期较长，且需要专业的测序仪和结果判读人员，不适合临床推广应用。微阵列芯片法具有高通量的优点，但存在检测成本高、操作繁琐、易交叉污染等缺点，不适用于大样本筛查的需求。PCR-RFLP法由于在PCR扩增结束后需开盖进行后续的酶切和电泳，同样存在操作繁琐、容易污染等问题。荧光定量PCR技术近年来在分子生物学领域的应用越来越广泛，其基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q)；探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。而且，随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(FAM、HEX、ROX等)及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。

针对荧光定量PCR传统Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，美国ABI公司于2000年推出一种新的Taqman探针——MGB探针，其3’端采用非荧光性的淬灭基团，在吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可极大提高探针与模板杂交的稳定性，使较短的探针同样能达到较高的Tm值。而短探针的主要优点在于荧光报告基团与淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，信噪比更高；同时，短探针也简化了设计和降低了成本。有实验表明MGB探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变。

发明内容

本发明的目的是提供一种线粒体耳聋常见突变A1555G的荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液、第一阳性对照品、第二阳性对照品、阴性对照品组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、第一荧光探针和第二荧光探针。

上游扩增引物序列为：5’-CATTTAACTAAAACCCCTACGCATTT-3’

下游扩增引物序列为：5’-GCACTTTCCAGTACACTTACCATGTT-3’

第一荧光探针序列为：5’-FAM-AGGAGGCAAGTCG-MGB-3’

第二荧光探针序列为：5’-HEX-TAGAGGAGACAAGTCG-MGB-3’

第一阳性对照品为线粒体第1555位点为A碱基的DNA样品，第二阳性对照品为线粒体第1555位点为G碱基的DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。

本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本发明试剂盒包括说明书和盒体。

本发明的另一个目的是提供所述的试剂盒在相关性耳聋线粒体A1555G突变检测中的应用。

本发明试剂盒使用方法：