[发明专利]一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法

权利要求书

1.一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，所述禽传染性支气管炎病毒为IBV H120，所述方法包括以下步骤：

(1)将IBV H120基因组编码区域分四段进行扩增，获得含有同源臂的片段，其引物分别为：

f1-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCCTTGTTTTGCCGTGTCTC-3’，

f1-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGATGCCTGTTACTGCGTGC-3’；

F2-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCGGTTTCTATTTCTGGCTCT-3’，

F2-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGTCACTACAGTCACGGCAG-3’；

F3-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCTTATGATCTCCTCAAGTATG-3’，

F3-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAG AATCCTGTGCAATGTCATA-3’；

f4-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCGATTATGTTTCTGACGCAC-3’，

f4-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGAGACAGATTAGACATTTCCC-3’；

将四片段分别与经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切的载体BAC同源重组，初步完成四片段亚克隆载体的构建；

对第一个亚克隆载体上BamHI酶切位点进行沉默突变并作为拯救标记，其引物为：上游引物：5’-TATTGTTGGCTCCAGTGTTGTTACTACA-3’，下游引物为：5’-AACACTGGAGCCAACAATAGCTTTCTTA-3’；

基因组5’UTR和3’UTR单独扩增，将第一个亚克隆载体和第四个亚克隆载体分别用BamHI和XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，分别与PCR扩增的5’UTR和3’UTR同源重组；

由此，获得覆盖基因组全长的四片段亚克隆载体，分别为pBAC-f₁、pBAC-F₂、pBAC-F₃、pBAC-f₄；

(2)扩增含有同源臂的CMV序列，将第一个亚克隆载体pBAC-f₁用BamHI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将CMV序列添加到第一个亚克隆载体基因组序列之前，获得改造的亚克隆载体pBAC-F₁；

扩增HDVR、BGH序列，将两个基因经融合PCR得到HB序列，设计含有同源臂的引物，扩增含有同源臂的HB序列，将第四个亚克隆载体pBAC-f₄用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将HB序列添加到第四个亚克隆载体基因组序列之后，获得改造的亚克隆载体pBAC-F₄；

由此，完成四片段亚克隆载体的改造；

(3)首先扩增含有同源臂的F2、F4片段，将第一个亚克隆载体pBAC-F₁和第三个亚克隆载体pBAC-F₃分别用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；然后利用同源重组策略，将F2片段融合到第一个亚克隆载体F1片段之后，将F4片段融合到第三个亚克隆载体F3片段之后；将四片段中相邻两片段两两融合，完成两个半分子亚克隆载体的构建，分别为pBAC-F₁F₂、pBAC-F₃F₄；

(4)扩增含有同源臂的F34片段，将含有F12片段的半分子亚克隆载体pBAC-F₁F₂用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；利用同源重组的策略，将F34片段融合到F12片段之后；将两个半分子片段融合，最终获得IBV H120基因组全长克隆重组质粒；

(5)将步骤(4)构建的含有H120病毒基因组全长cDNA克隆重组质粒转染BHK-21细胞，细胞置于37℃的培养箱中培养48h后，收获培养基及细胞混合物，反复冻融3次，得到P0代拯救毒，将P0代拯救毒无菌过滤后接种10日龄SPF鸡胚，3天后收获鸡胚尿囊液，盲传3代，最终获得鸡传染性支气管炎病毒H120反向遗传疫苗株。