[发明专利]一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述重组抗原组合物包含弓形虫SAG1特异表位重组抗原、弓形虫SAG3特异表位重组抗原、弓形虫GRA3特异表位重组抗原和弓形虫MIC3特异表位重组抗原。

2.根据权利要求1所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位重组抗原、SAG3特异表位重组抗原、GRA3特异表位重组抗原和MIC3特异表位重组抗原在所述重组抗原组合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例组合。

3.根据权利要求1所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位重组抗原的特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸到第316个氨基酸；SAG3特异表位重组抗原的特异表位为SAG3蛋白N端第41个氨基酸到382个氨基酸；GRA3特异表位重组抗原的特异表位为GRA3蛋白N端第44个氨基酸到第160个氨基酸；MIC3特异表位重组抗原的特异表位为MIC3蛋白N端第38个氨基酸到第383个氨基酸。

4.一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：

(1)抗原表位的筛选

分析弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫SAG3蛋白特异性抗原位于第41个氨基酸到第382个氨基酸；弓形虫GRA3蛋白特异性抗原位于第44个氨基酸到第160个氨基酸；弓形虫MIC3蛋白特异性抗原位于第38个氨基酸到第383个氨基酸；

(2)弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因克隆

分别设计SAG1、SAG3、GRA3和MIC3的上、下游引物，以弓形虫DNA为模板，分别用设计的上、下游引物扩增弓形虫SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白抗原表位的基因片段，电泳胶回收目的片段，置-20℃冻存备用；

(3)分别构建SAG1、SAG3、GRA3和MIC3蛋白表达载体

提取PGEX-6P-1和PRSET-B质粒，将PGEX-6P-1、PRSET-B质粒分别经过双酶切，电泳后分别胶回收PGEX-6P-1、PRSET-B双酶切的质粒片段；SAG1蛋白、SAG3蛋白、GRA3蛋白和MIC3蛋白分别经过双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段，-20℃备用；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，分别得到重组质粒。

5.根据权利要求4所述的一种用于诊断弓形虫抗体的重组抗原组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法还包括下列步骤：

重组质粒的筛选和鉴定：

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含氨苄青霉素LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，将分别提取的质粒双酶切，跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；

蛋白工程菌高效表达：

将鉴定阳性表达菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5-1.5mmol/l IPTG，25℃条件下继续诱导过夜,离心收集沉淀的菌体，再将菌体进行破碎，破碎后收集的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测；上清中含有PGEX-6P-1-GRA3和PGEX-6P-1-SAG1表达的目的蛋白，PRSET-B-SAG3和PRSET-B-MIC3以包涵体形式表达存在于沉淀中；

表达蛋白的纯化：

将重组蛋白工程菌液离心，收集的沉淀菌体重悬于原离心体积1/10的裂解液内，冰浴超声菌体10-30min后，离心，分别收集菌液上清和沉淀的包涵体；取菌液上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，离心，弃上清，沉淀中加入8-12倍标准体积的PBS，混匀，再经过离心、弃上清，收集沉淀，向沉淀中加入1-3倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，搅动，离心后将收集的上清移至新管中，在PBS中透析24-48h，离心取上清，-20℃备用；取沉淀的包涵体，并用含0.5％SKL缓冲体系溶解，室温裂解包涵体、离心，收集上清，将上清经过透析过夜，再离心过滤膜后上镍柱纯化。