[发明专利]一种重组吸水链霉菌及其在提高井冈霉素A产量中的应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种对井冈霉素A发酵生产菌株的基因工程改造，即将糖基转移酶基因valG和UDPG合成途径中galU和pgm的关键酶基因过量表达，提高井冈霉素A的合成能力。

(二)背景技术

井冈霉素高效低毒，对环境友好，不易发生真菌抗药性，是我国及东南亚水稻主产区用于防治水稻纹枯病、稻瘟病的主要生物农药之一。井冈霉素具有独特的作用机理，被真菌细吸收后水解成为井冈羟胺A，从而发挥抑菌作用。井冈羟胺A对海藻糖酶有强烈的抑制作用，在真菌细胞中海藻糖属于重要的贮藏类碳水化合物，通过海藻糖酶降解海藻糖来供应能量和葡萄糖。井冈羟胺A通过抑制海藻糖酶从而使真菌无法获得充足的葡萄糖，抑制菌丝的生长。研究表明，井冈羟胺A是井冈霉素类化合物中对海藻糖酶抑制剂作用最有效的，与海藻糖酶有极高的亲和力。这是因为井冈霉素A比井冈羟胺A更容易进入菌丝体，通过真菌体内的β-葡萄糖苷酶水解成井冈羟胺A，从而阻碍真菌的葡萄糖供应系统抑制其生长。

在链霉菌合成井冈霉素A的代谢途径研究方面，通过基因置换实验和回补实验证实了其合成途径中的valG基因发挥糖基转移功能，即利用UDP-葡萄糖(UDPG)，将井冈羟胺A糖基化合成井冈霉素A。UDPG作为糖基化底物，提高其胞内含量，有助于糖基化反应。如通过体外添UDPG，胞内UDPG含量的增加会提高井冈霉素A的产量，同时前体井冈羟胺A的量有所减少，从而初步证明增加UDPG的胞内含量可以促使井冈羟胺A向井冈霉素A转化。已有研究表明，通过基因工程手段过量表达UDPG焦磷酸化酶，显著可提高胞内UDPG的浓度。而在大肠杆菌中过量表达葡糖磷酸变位酶(pgm)和UDPG-焦磷酸化酶(galU)，UDPG产量提高近60％。所以，通过基因工程使UDPG合成的关键酶UDP-葡萄糖焦磷酸酶过量表达，同时提高糖基化酶VlaG的活性，预期可以提高S.hygroscopicus var.jinggangensis 5008的井冈霉素A合成能力。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种加强井冈霉素A生产菌胞内糖基化反应的方法，即通过基因组整合型表达质粒pIJ8630-valG-galU-pgm，改造生产菌株基因组，实现胞内过量表达糖基转移酶ValG和UDPG合成途径中UDPG-焦磷酸化酶(galU)和葡糖磷酸变位酶(pgm)，促进井冈羟胺A糖基化生成井冈霉素A，提高井冈霉素A的产量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组吸水链霉菌，所述重组吸水链霉菌是将糖基转移酶基因valG、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU和葡萄糖磷酸变位酶基因pgm导入吸水链霉菌获得的。

进一步，所述糖基转移酶基因valG核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因galU核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。所述葡萄糖磷酸变位酶基因pgm核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

进一步，所述重组吸水链霉菌以吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008为宿主菌。

本发明还提供一种所述重组吸水链霉菌在提高井冈霉素A产量中的应用。具体，所述的应用是将重组吸水链霉菌接种至发酵培养基，在35-40℃，180-220r/min培养，发酵结束后，取发酵液于12000r/min离心2min，上清液经0.22μm水膜过滤除菌，收集滤液(即含井冈霉素A溶液)，滤液提纯，获得井冈霉素A；所述发酵培养基终浓度组成为：玉米粉100g/L，黄豆饼粉25g/L，酵母粉50g/L，NaCl 1g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。

进一步，所述重组吸水链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度5～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将重组吸水链霉菌接种到种子培养基中，37℃、220r/min恒温培养24h，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：玉米粉30g/L，黄豆饼粉22g/L(煮透、过滤去沉淀)、酵母粉10g/L，NaCl2g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。

本发明所述重组吸水链霉菌工程菌的制备方法为：

(1)孢子悬浮液的制备