[发明专利]一种艾伯特埃希菌的检测方法

权利要求书

1.一种艾伯特埃希菌非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采集25g食品+225ml EC肉汤增菌液；或，3ml脑心-甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9ml EC肉汤增菌液，于20℃培养18-36h；

2)取1ml上述经培养后的EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×Taq MasterMix 10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃ 2min，变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照；PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测；

3)用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色的较大菌落；然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，每一个单个可疑无色菌落的二分之一作为PCR反应模板检测eae基因；且每一个单个可疑无色菌落的另二分之一用于后续纯培养；

4)接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果；

5)将上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落作为疑似艾伯特埃希菌；无菌接种环挑取少量纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续的三重PCR鉴定、16SrDNA序列分析及MLST分析。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述食品选自生牛肉、生猪肉、生羊肉、生鸡肉、生鸭肉、新鲜鸡肠或新鲜鸭肠；所述2ml稀大便或2g干粪便来自腹泻患者、家禽家畜、野生鸟类粪便标本；所述家禽家畜选自鸡、鸭或家养鸽子；所述野生鸟类选自白鹭、麻雀或燕子。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述裂解液的配方为：100mM NaCl，pH8.3的10mM Tris-HCl，pH9.0的1mM EDTA，1wt％Triton X-100。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，用10μl一次性无菌接种环挑取15mm纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述三重PCR鉴定具体为：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可初步确认为艾伯特埃希菌；其中三重PCR所用的引物见下表1：

表1三重PCR所用的引物

PCR反应体系为：在50μl体系中，2×Taq MasterMix 25μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水18μl；反应条件：预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，退火58℃ 30s，延伸72℃30s，35次循环，最后72℃延伸5min，每次扩增均设有阴、阳性对照；取上述PCR产物5μl，以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述16S rDNA序列分析具体为：

扩增艾伯特埃希菌16S rDNA的引物为EA16S-F:GGATCCAGACTTTGATYMTGGCTCAG和EA16S-R:CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；其中PCR反应体系为：在50μl体系中，2×TaqMasterMix25μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板2μl，纯水19μl；PCR反应条件：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循环，最后72℃延伸7min，每次扩增均设有阳性和空白对照；

取PCR产物5μl以1.5wt％琼脂糖凝进行电泳，通过凝胶成像系统观察是否扩增出目的大小片段，PCR产物均纯化后进行测序；利用SeqMan软件对测序结果进行峰图查看，并在NCBI数据库中进行比对检索，初步判断结果；利用MEGA6.0软件，以NCBI上公布的大肠埃希菌、志贺氏菌、费格森埃希菌的16SrDNA序列为参考，采用Neighbor-joining法构建系统进化树，进行分类位置分析。