[发明专利]一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法

说明书

本发明公开了一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，所述方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序。本发明利用二醛和单醛分别对壳聚糖进行交联反应，形成氨基反应完全且富含羟基的的交联壳聚糖基质；利用交联壳聚糖与甲基环氧氯丙烷进行交联活化反应，避免了赭曲霉素A单抗中的结合活性位置与交联壳聚糖的非特异性相互作用，使绝大部分抗体处于游离状态；交联壳聚糖的活化反应与偶联抗体的反应分开进行，从而最大限度的保证了赭曲霉素A单抗的活性。

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法。

背景技术

赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素。其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A。与黄曲霉毒素的检测方法一样，赭曲霉毒素A的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、免疫亲和层析柱-高效液相色谱法、免疫亲和层析柱-荧光光度法等。目前免疫亲和层析柱-高效液相色谱法和免疫亲和层析柱-荧光光度法，具有快速、灵敏、准确的特点，已被国家标准GB/T 18979-2003所采用。免疫亲和层析柱-高效液相色谱法和免疫亲和层析柱-荧光光度法的核心技术就是制备性能稳定、安全可靠，结果可以信赖的免疫亲和柱。目前亲和柱固定基质的选择分几大类：高分子材料、生物大分子、生物高分子材料。在上述几种材料中，生物高分子材料具有环境友好，价格便宜等优点，已经成为研发的热点。

壳聚糖作为一种廉价易得的生物高分子材料已经越来越得到广泛地应用于各种生化检测材料中。壳聚糖分子中具有氨基和羟基，因此改性的方式多，反应灵活。经过改性，壳聚糖也能形成结构规整的微球。目前壳聚糖的改性交联主要通过其结构上的氨基与醛类形成席夫碱来实现。壳聚糖上的氨基完全席夫碱化留下的羟基则能够保证下一步与抗体偶联反应的均一性和稳定性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取技术方案是：一种赭曲霉素A免疫亲和柱的制备方法，所述方法包括交联壳聚糖基质的制备、抗体与交联壳聚糖的偶联以及装柱工序，具体工艺步骤如下所述：

1)交联壳聚糖基质的制备：

称取壳聚糖溶于体积分数1％醋酸溶液中，搅拌并超声至完全溶解；壳聚糖经过二醛交联、单醛交联，真空干燥得到交联壳聚糖基质；

2)抗体与交联壳聚糖的偶联：

a.取步骤1)交联壳聚糖，悬浮于甲基环氧氯丙烷中，缓慢滴加氢氧化钠水溶液，于50-70℃恒温水浴振荡器上活化反应4-8h，反应结束后，用水反复洗涤，真空干燥，得到活化壳聚糖备用；

b.将活化壳聚糖分散于赭曲霉素A抗体的缓冲液中，于35-39℃恒温水浴振荡器上偶联反应，直至溶液中赭曲霉素A抗体的浓度不发生变化为止，待反应结束后，得到偶联抗体的交联壳聚糖混悬液；

3)装柱：

取步骤2)制备的混悬液装柱，沉降，分别用纯水、磷酸盐缓冲液进行洗涤至赭曲霉素A抗体不能检出，在4℃下磷酸盐缓冲液中保存，即得到赭曲霉素A免疫亲和柱。

优选地，所述步骤1)中的所述二醛交联、单醛交联方法为：待壳聚糖在1％醋酸溶液中完全溶解后，将二醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应；然后将单醛缓慢的滴入瓶中交联固化，搅拌反应，冷却，加入与水互溶的溶剂帮助沉淀，过滤，滤饼用与水不互溶的溶剂洗涤，将过滤得到的滤饼于真空干燥，得到白色粉末，即为交联壳聚糖基质。

优选地，所述步骤1)中二醛交联，二醛添加量为壳聚糖质量的1-2倍；搅拌反应时间为2-4h，搅拌反应温度为20-40℃。