[发明专利]一种表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株

说明书

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒株。

背景技术

我国自1994年首次报道从鸡群中分离到H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)以来，该亚型禽流感在我国一直呈地方性流行，严重危害我国养禽业的发展。H9亚型AIV传播能力强，流行范围广，感染家禽主要表现为产蛋下降，该亚型病毒虽然对鸡低致病性，但并发或继发感染其他病原可引起高发病率和死亡率，给我国养禽业造成巨大的经济损失。

目前灭活疫苗的使用成为预防和控制禽流感的主要手段，但常规的灭活疫苗存在着一些难以克服的缺陷：灭活疫苗生产费时费力，且油乳佐剂会引起局部的不良反应，导致动物不适和肉质下降；不能诱导有效的细胞免疫应答和粘膜免疫IgG抗体的产生，因而无法有效地抑制呼吸道中流感病毒的复制；免疫效率低下，免疫剂量大，不能与自然感染区分，影响禽流感的监控，而且存在着散毒的危险等。因此，急需研制新型禽流感疫苗来克服现有疫苗的不足。而基因重组活载体疫苗在很大程度上可以避免上述情况。

目前用于构建重组病毒的活载体有很多，如马立克氏病毒(MDV-1)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、鸭瘟病毒(DEV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)等。与其他禽病毒载体相比，HVT具有很多独特的优势。其优势主要包括：HVT有20多个可供外源基因插入的复制非必需区，因此其复制非必需区可以插入较长外源基因，有利于构建多价重组活疫苗，其中已报道的复制非必需区有US1、US2、US3、US6、US10、US7、UL23、UL44、UL45、UL46、TK、PK等；HVT可在鸡体内持续感染，为外源基因的表达提供良好的活载体，可以刺激机体持续的产生抗体；HVT作为疫苗对鸡无致病性，不影响其生产性能，安全性好；HVT可刺激机体产生坚强的细胞免疫反应，且持续时间长，接种一次可达到终生免疫的效果；HVT具有很强的细胞结合特性，可以在细胞间传播；以HVT为载体的基因工程苗可以突破母源抗体的干扰等。因此，以HVT为载体的基因工程苗具有广阔的应用前景。

就AIV而言，HA蛋白作为主要免疫保护性抗原，是体液免疫的靶抗原，主要诱导机体产生中和抗体，因此如何能够以火鸡疱疹病毒(HVT)为载体进行H9亚型禽流感病的活疫苗研究成为一项亟待攻克的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒株，该病毒株可用于家禽中诱导针对H9亚型AIV的保护性免疫应答。

本发明首先提供一种在火鸡疱疹病毒中插入外源基因的方法，是将外源基因插入火鸡疱疹病毒(HVT)的两个插入位点US2和US10，

更具体的，所述的插入位点位于HVT基因组US2区的140276nt-140285nt之间。

本发明再一方面提供一种重组火鸡疱疹病毒，是通过在火鸡疱疹病毒的US2区和US10区分别插入H9亚型禽流感病毒HA基因和H9亚型禽流感病毒的HA2基因构建的；

本发明所提供的表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组火鸡疱疹病毒(rHVT-H9-HA)株，于2017年1月18日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201707。

本发明的rHVT-H9-HA株用于表达HA基因蛋白，

本发明的rHVT-H9-HA株的另一方面的用途是用于制备疫苗；

本发明以火鸡疱疹病毒(HVT)FC-126疫苗毒株为载体，分别以其复制非必需区US2和US10为插入位点，构建表达EGFP标记基因的重组病毒rHVT-EGFP。本发明选择H9亚型禽流感病毒YZ140706株的HA基因完整的开放阅读框和HA2基因分别构建表达盒，再次利用同源重组原理，用上述两个基因表达盒分别替换重组病毒rHVT-EGFP的标记基因eGFP，分别筛选出表达完整HA基因和部分HA基因的重组HVT。

免疫保护评价结果表明，本发明的rHVT-H9-HA株对H9亚型禽流感病毒，可以提供100％攻毒保护。

附图说明

图1：转移的构建模式图；

图2：重组病毒rHVT-H9-HA的构建示意图；

图3：HA基因及其表达盒PCR电泳图；

图4：重组病毒rHVT-EGFP的荧光图；

图5：重组病毒rHVT-H9-HA的噬斑图；

图6：鉴定重组病毒rHVT-H9-HA外源基因表达的IFA试验；