[发明专利]猪pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种猪CRTC3的pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建方法，包括以下步骤：1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；2)、pCRTC3‑sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330‑Cas9载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3‑sgRNA表达载体的重组质粒。本发明还同时公开了上述pCRTC3‑sgRNA表达载体的用途：用于敲除猪细胞中pCRTC3基因的表达；用于研究pCRTC3基因对猪肠道上皮细胞IPEC‑J2细胞紧密连接蛋白和糖脂代谢关键基因表达产生的影响。

技术领域

本发明涉及一种猪CRTC3(pCRTC3)基因的pX330-Cas9-pCRTC3-sgRNA(pCRTC3-sgRNA)表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

糖脂代谢是最主要的生命活动之一，直接影响着动物的脂肪沉积。在畜牧生产中，糖脂代谢直接影响着畜产品的产量和品质；同时，糖脂代谢也与人类健康息息相关。因此，探讨动物糖脂代谢及其对脂肪沉积的影响及调控机制，对畜牧生产和人类健康都有非常重要的意义。研究证实，环磷酸腺苷(cAMP)信号通路直接调控能量平衡和养分分配。cAMP信号通路主要是通过cAMP应答元件结合蛋白(CREB)及其调节转录辅激活因子(CRTCs)发挥转录调节功能CRTC3是CRTCs家族的一员，在糖脂代谢过程中发挥着重要的功能。

CRTC3具有高度保守的N端CREB结合域，在细胞核上与CREB的bZIP结构域结合并提高CREB的活性。CRTC3的亚细胞定位主要受磷酸化调控，去磷酸化介导的CRTC3进核是上调CREB靶基因的一个关键步骤。研究发现，CRTC3去磷酸化促进肝细胞中糖原异生基因表达、增强葡萄糖生成。在肌肉中，CRTC3的去磷酸化使其快速转运进核，促进PGC1a基因表达，并影响肌肉内脂肪代谢和沉积。在脂肪组织中，SIK2直接磷酸化CRTC3，调控脂肪细胞中GLUT4表达和葡萄糖摄取；全身敲除CRTC3的小鼠能量消耗增加、抑制肥胖。而且，CRTC3可能与少年的肥胖相关。研究表明，STK11的底物如AMPK能磷酸化CRTC3，抑制CREB的靶基因表达。最近我们研究发现，STK11与CRTC3能直接互作，STK11缺失促进CRTC3进核并影响脂肪细胞分化。提示：CRTC3的亚细胞定位可能与脂肪细胞分化和脂质代谢密切相关。但目前关于CRTC3在脂质代谢方面的研究报道甚少，未见关于猪CRTC3的研究报道。因此，开展pCRTC3在动物肠道功能、脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。

CRISPR/cas9基因编辑技术一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别与编辑，是一种较高效的基因定点修饰技术，具有速度快、效率高、简单经济等特点，在哺乳类细胞模型及动物模型构建的应用前景非常广阔。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法，以及该pCRTC3-sgRNA表达载体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪CRTC3(pCRTC3)的pCRTC3-sgRNA(pX330-Cas9-pCRTC3-sgRNA)表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)、根据载体的内切酶位点信息和pCRTC3序列(pCRTC3全长基因序列)得到4个靶序列，根据所述靶序列设计并合成4对sgRNA引物；

2)、pCRTC3的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：BbsI酶切的pX330-U6-Chimeric-BB-CBh-hSpCas9(缩写为pX330-Cas9)载体与pCRTC3的sgRNA引物退火后产物连接转化，得到pCRTC3-sgRNA表达载体的重组质粒。

作为本发明的pCRTC3-sgRNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为：根据pCRTC3全长基因序列，筛选并设计4对sgRNA引物；该4对sgRNA引物分别为：