[发明专利]一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于HRM检测基因多态性的引物组合物的应用，属于基因多态性(SNPs)检测领域。

背景技术

单核苷酸多态性即SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、G、C、T)替换而引起的多态性，是新一代多态性遗传标记。SNPs在生物基因组中广泛存在，如人类30亿个碱基中每千个碱基出现一次，在整个基因组共有300万以上的SNPs。SNPs在人类疾病研究，尤其是精准医疗、肿瘤和遗传病的早期检测、胎儿遗传病筛查中具有重要应用价值。现在已知许多遗传病跟特定的基因位点变异有关，还有些药物的治疗效果跟个体的特定基因SNP型相关，例如氯吡格雷的治疗效果就与个体的特定基因SNP型相关，现有技术表明药物代谢酶的基因多态性是影响氯吡格雷疗效的主要因素，其是近年来精准医疗的热点。根据相关文献报道，CYP2C19*2的SNP型与氯吡格雷的治疗效果相关。CYP2C19*2基因型是CYP2C19基因的第5外显子在第681位的突变(681G/A)，可造成外显子5'端40bp碱基缺失，并改变之后的mRNA阅读框架，产生出一个无功能的蛋白(CYP2C19*2酶)。

鉴于SNPs的重要应用价值，目前已开发多种方法用于SNPs的检测，主要有以下几种：

(1)限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)，该方法利用限制性内切酶对PCR片段进行酶切，通过电泳区分片段，根据电泳结果区分是否存在SNP。

(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)，该方法利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分开。

(3)测序法，对SNP所在DNA区段进行直接测序比较，即可明确不同材料SNP类型。

然而，上述电泳及其他常见的核酸变异分析技术需要复杂的处理，无法真正实现闭管操作，容易引起污染导致假阳性检测，难以实现批量自动化分析。

HRM技术是在定量PCR的基础上发展起来的后PCR分析方法，通过监测双链DNA熔解曲线的变化来区分DNA变异，其分辨率最高可以区分单碱基差异。扩增和分析都是在封闭的体系内自动完成，而且一次可以进行384个反应，有望克服上述现有检测SNPs技术的缺陷。然而，由于SNP差异引起的T_m值很小，该差异值仅略高于高精度仪器的分辨率，实验误差稍微高一点，就无法稳定地区分不同基因型，具体而言，单个碱基差异的双链DNA的熔解温度(T_m值)差异通常只有0.1～0.5℃，虽然仪器的温度分辨率能达到0.1℃，但是实际上由于重复性等因素影响，相同样品间的T_m值误差也在0.1～0.3℃，导致实验的稳定性差，结果可信度低。因此，HRM技术的以上缺陷严重限制了其在检测SNP中的应用。

因此，本领域亟需开发一种稳定性高，结果可信度高，简单方便，检测样品规模大的检测SNP的技术。

发明内容

有鉴于本领域对SNP检测的迫切需要，本发明的目的之一在于提供引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用，该引物组合物能够应用于HRM，高效可靠的检测SNP。

为此，本发明提供一种引物组合物或含其的试剂盒在制备基于HRM检测基因多态性的系统中的应用；

所述引物组合物包括正向引物F、反向引物R、SNP特异引物1和SNP特异引物2；所述正向引物F和所述反向引物R用于扩增基因中共有保守序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物1用于扩增等位基因1特异性序列，所述正向引物F和所述SNP特异性引物2用于扩增等位基因2特异序列；

SNP特异引物1和SNP特异引物2其中之一为5’端增加了GC尾巴的修饰的SNP特异引物。

本发明中所述系统也可以称为一种“套组”或“套件”，其中包括了本发明中引物组合物或含其的试剂盒，亦可包括其他试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种产品例如试剂套件的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装后成套销售及使用。

本发明所述修饰的SNP特异引物是指在正常设计的SNP特异引物上进行修饰。