[发明专利]对E.coli O157:H7免酶及免荧光标记的检测方法有效
| 申请号： | 201710522391.7 | 申请日： | 2017-06-30 |
| 公开（公告）号： | CN107817228B | 公开（公告）日： | 2022-06-14 |
| 发明（设计）人： | 邹立扣;陈姝娟;付珍珍;余华;严玉宝;刘书亮;周康;敖晓琳;何利;杨勇 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学;中华人民共和国四川出入境检验检疫局 |
| 主分类号： | G01N21/64 | 分类号： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 成都玖和知识产权代理事务所(普通合伙) 51238 | 代理人： | 黎祖琴 |
| 地址： | 610000 四川省成*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | coli o157 h7 荧光 标记 检测 方法 | ||
1.一种对Escherichia coli O157:H7进行无酶及无标签化的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将IS与适配子杂化，所述IS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)所得物置于缓冲液中，加入Escherichia coli O157:H7，于37℃下反应30min；
(3)向步骤(2)所得物加入GHP1和GHP2，于37℃孵育100min；所述GHP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述GHP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(4)向步骤(3)所得物加入NMM，于37℃下孵育30min；所述NMM为N-甲基中卟啉IX；
(5)对步骤(4)所得物进行荧光强度检测；
其中，步骤(1)所述杂化的条件为：于80～90℃，处理40-55min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IS和适配子在使用前于90℃下处理5分钟，之后缓慢冷却至室温。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IS的浓度为3μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述适配子的浓度为3μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GHP1的浓度为3μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GHP2的浓度为3μM。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NMM的浓度为15μM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，进行检测时，激发波长为399nm，发射波长为580nm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl、5mMKCl、100mM NaCl、1mM MgCl2,pH 7.4。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，检测波长为609nm。
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