[发明专利]基于His标签的PNGaseF固定方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶领域，具体涉及一种基于His标签的PNGase F固定方法。

背景技术

N-糖酰胺酶(EC 3.5.1.52,Peptide-N-Glycosidase F,简称PNGase F)能够专一性的识别连接的糖基化位点，并将糖链从糖蛋白的天冬酰胺位置水解。目前为止，PNGase F因为生产条件所限，生产周期长，纯化步骤繁琐，所以产量偏低，价格高，且PNGase F不能重复利用。近年，有研究者试图通过传统的固定化酶方法对PNGase F进行固定，从而达到高效、可重复性地利用PNGase F；常用的固定方法有物理方法：如吸附，包埋等，但固定后的酶容易被洗脱，所以用的不多；另外一种化学法是采用碳二亚胺或者戊二醛的方法非定向固定。也有报道证明PNGase F已成功固定在碳纳米管、整体柱、纳米金刚石以及磁珠等固定材料上，然而这些固定都是PNGase F的氨基与固定材料表面的羧基随机进行的反应，因为PNGase F并不仅仅只有N-端有氨基，在蛋白质上还有很多氨基，这些氨基随机地与固定材料上的羧基耦联，使固定后的PNGase F的活性将会大大受到影响。

发明内容

针对现有技术中固定化存在的缺点，我们采用了PNGase F表达过程中使用的His标签进行酶的定向固定，这种方法的固定效率远远高于传统的物理方法，不易被缓冲液或反应液洗脱，而且不同于一般的非定向化学固定，不干扰酶活性。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种基于His标签的PNGase F固定方法，该方法将His标签的PNGase F与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)进行固定，具体包括如下步骤：

(1)含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)使用耦联缓冲液清洗三次，所述的耦联缓冲液为：20mM Tris,50mMNaCl,pH 7.5。

(2)步骤(1)的MNP-IDA/Ni中加入带有His标签的PNGase F酶液，4℃，100rpm/min反应60min，所述MNP-IDA/Ni与PNGase F酶的体积比为5:2；

所述带有His标签的PNGase F酶液的制备方法为：

A、PNGase F酶所属的E.coli DE3细胞培养于含有卡那霉素的LB培养基，当培养细胞浓度的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，250rpm/min，37℃条件下诱导3小时；

B、8000rpm/min离心10min，收集步骤A诱导表达的细胞，弃培养基上清，使用裂解缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，pH 7.5)重悬细胞沉淀；

C、步骤B的重悬液置于冰上超声破碎20min，3s超声/3s间歇；

D、以12000rpm/min离心10min，分离步骤C破碎后的细胞裂解液，弃上清；

E、将步骤D的沉淀再次使用裂解缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，pH 7.5)重悬，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；

F、重复步骤E三次；

G、使用漂洗缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，4M Urea，pH 7.5)再次重悬并漂洗步骤F的沉淀，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；

H、使用变性缓冲液(20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，8M Urea，pH 7.5)再次重悬步骤G的沉淀，并转移至摇床100rpm/min，37℃变性30min；

I、12000rpm/min离心10min，分离步骤H变性后的溶液，上清转移至透析袋，透析至保存缓冲液(20mM Tris,pH 7.5)。

(3)偶联固定后的MNP-IDA/Ni-PNGase F置于磁场中分离，弃上清,然后加入耦联反应液重悬MNP-IDA/Ni-PNGase F，清洗MNP-IDA/Ni-PNGase F，磁分离，弃上清，使用耦联反应液清洗3次。