[发明专利]包含神经干细胞、EGF和FGF‑2的组合物

说明书

技术领域

本发明涉及神经干细胞以及培养神经干细胞培养条件和方法，特别提供了包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物。

背景技术

虽然据说神经干细胞可在体外分离自多种来源，但迄今仍不可能在对称分裂、未分化状态的大规模培养中扩展细胞。从实验和治疗观点来看，都非常需要使在此状态中长期扩展细胞。获得的纯神经干细胞群体能够定向分化为三种细胞类型：神经元、星形细胞和少突胶质细胞。

培养神经干细胞（虽然作为不均一细胞群体的一小部分）的一种已知方法是神经球(neurosphere)系统。此系统包括连续传代不均一的细胞聚集体，其中仅有一小部分是真正的神经干细胞。神经球中的大多数细胞是定型祖细胞。

有许多关于神经球的不均一性和不稳定性，以及它们产生神经元的能力有限的报道(如Morshead等，2002)。Rappa等，Neuroscience 2003报道了以下方法：将神经球细胞平板接种在纤连蛋白上1-7天以转染神经球细胞，然后重建神经球但不提供神经球内干细胞（如果有）的显著表征。

Suslov等，2002提供了明确数据证明，神经球系统太不均一，以致于不能有意义地表征其中的任何干细胞。主要结论是，神经球内不仅不均一一”显示克隆内神经细胞谱系多样性，即除NSC以外，它们含有不同分化状态的神经元祖细胞和神经胶质祖细胞”一而且不同克隆神经球品系之间的基因表达型存在很大差异。正如论文中明确确认的那样，Suslov的基因表达型分析没有建立神经球内干细胞的定义：一“获得的分子表型表明我们系统中的产克隆NSC是不均一的，其中的亚组反映出不同的神经发育定型”。

本领域的许多文献描述了胶质细胞的特性。Skogh等，MCN 2001描述了表达GFAP以及对RC2和干蛋白染色易变的胶质细胞培养物一应注意，在体内，放射状胶质中不表达小鼠GFAP (Rakic，2003)。他们报道，他们的细胞不表达神经原性放射状胶质的标记Pax6 (Malatesta等，2001，2003)，他们没有检测到其它放射状胶质标记。他们有不均一的培养物，没有进行克隆分析。

关于体外放射状胶质的其它报道认为它们是分化中间体或最终产物。因此，Bibel等(Nat Neurosci，2004)报道了从ES绌胞通过瞬时放射状胶质样细胞产生神经元，Gregg和Weiss (JNeurosci，23：11587-601，2003；美国专利公开2003/0032181)描述了神经球细

胞”分化”为放射状胶质。Hartfuss等(Dev Biol，2001)证明，放射状胶质存在于神经球。Gregg和Weiss发现，放射状胶质是神经球的分化产物，可以断定“这些结果表明神经干细胞可产生RGC[放射状胶质细胞]和成年动物CNS中可重演(recapitulate) RGC指导的迁移”。流行的观点是：放射状胶质是神经球产生的分化细胞类型之一。

Liour和Yu (Glia，2003)证明，放射状胶质细胞分化可获自ES细胞，但本领域的其它报道没有提到神经原性放射状胶质的扩展。

Gobbel等，Brain Res 2003报道了多能大鼠细胞能增殖为“松散地粘附于基材上生长的细胞的球状簇”，即不形成均一的单层。而且，此论文的摘要断定：“这些细胞在3次分裂中大约两次产生有丝分裂后细胞，因此使扩展困难”。他们的培养物中广泛出现产胶质细胞的分化，但作者发现“相对少”(<3%)神经元。他们没有提供细胞的分子表型。

W0 01/30981描述了可分化为神经元的细胞的培养物。但这些细胞是GFAP和干蛋白阳性，被描述为星形胶质细胞，是相对不纯的混合群体。干细胞需要特定细胞微环境或小生境的观点是干细胞生物学中的正统观点。虽然不总是承认，但已知神经球干细胞仅构成祖细胞、母细胞和未成熟的分化后代等全部细中的一小部分。此种混合细胞类型的聚集可构成其中可能有干细胞的小部分细胞的小生境。

文献中没有报道过由ES细胞产生神经干细胞的均一群体，仅产生可能在变为胶质细胞限制性之前瞬时扩展的神经上皮前体细胞(如Brustle等，Sclence 1999)。因此，本领域中存在许多问题。所有报道都承认他们的培养物是不均一的。不可能用神经球系统维持对称分裂和不分化状态的神经干细胞的大规模培养。培养大量神经干细胞的其它尝试没有成功地超过5-20代，细胞高度倾向于分化乜阻碍了这些尝试。例外是有关成年大鼠海马干细胞的工作，但这些是染色体组型异常，并且低效率地形成神经元。