[发明专利]一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒培养用的体外模型，具体地，涉及一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法。

背景技术

在病毒学的发展史中，常利用易感动物如家兔、小白鼠、豚鼠等对目的病毒进行实验。动物模型可以观察病毒对机体的侵害，造成病理变化的部位，但动物个体差异大，价格昂贵，还需要特殊的动物房，因此推广起来成本巨大。随着科学的发展，也出现了很多体外培养病毒的模型，但常规的细胞培养技术模型往往并不能反应病毒在体内的致病过程。

发明内容

发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，运用三维培养技术，既能避免动物体内实验带来的高成本，又能最大程度的模拟动物体内生长模式，使所培养的细胞呈现立体生长方式，形成类似体内的组织结构，进而有助于模拟病毒体内的致病过程，该模型方法简便，成本低廉，推广方便。

技术方案：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取1-3份的微载体，置于玻璃容器内，按照微载体1份：50ml磷酸盐缓冲液的比例加入磷酸盐缓冲液，混匀1-3h，然后再用新鲜的清洗液洗涤2-3次，再按照微载体1份：50ml磷酸盐缓冲液的比例加入新鲜的磷酸盐缓冲液，高压灭菌，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀10-30分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述细胞的培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清；所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠10-20份、丙酮酸钠8-18份、丝胶蛋白3-12份、氯化钾 30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、N-异丙基丙烯酰胺0.1-0.5份、亚麻酸0.3-3份、乙醇胺0.5-0.8份、芳香酸酯0.2-0.9份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份；

再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，3-4天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

该模型的建立既能避免动物体内实验带来的高成本，又能最大程度的模拟动物体内生长模式，使所培养的细胞呈现立体生长方式，形成类似体内的组织结构，进而有助于模拟病毒体内的致病过程，该模型方法简便，成本低廉，推广方便。

进一步的，上述的一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述微载体为Cytodex3。与Cytodex1/2相比，该种微载体实用性更广，适合更多类型的细胞接种，便于多种疾病模型的建立。

进一步的，上述的一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述细胞贴壁阻滞剂为poly-hema。该阻滞剂可以有效的阻止细胞贴附在培养板底部，进而促进三维培养模型的顺利建立。

进一步的，上述的一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述高压灭菌时的温度为120℃-140℃，灭菌时间30-50分钟。

进一步的，上述的一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，

氯化钠：50-80份

氯化钾：2-5份

磷酸氢二钠：10-15份

磷酸二氢钾：1-5份

氯化镁：8-10份

葡萄糖：5-10份

去离子水：40-50份。

进一步的，上述的一种新型病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10X的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整pH=7.3。