[发明专利]一种含二硫键长臂生物素及其制备方法

说明书

本发明提供一种含二硫键长臂生物素及其制备方法，该化合物可应用于生化检测领域，减少位阻效应的影响，提高检测的灵敏度，其结构为，以生物素为原料，经酰化乙二胺、二硫代丙酸酰化、活性酯合成制备了含二硫键生物素。

技术领域

本发明涉及新型生化试剂领域，具体的说是一种含二硫键的长臂生物素的制备方法。

背景技术

生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的 卵黄（α型）和肝组织（β型）中提取，α、β两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31，分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

近几十年来，利用生物素及衍生物作为标记探针得到了迅速发展，生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂为亲和素和链霉亲和素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低．结合紧密且快速。抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。大多数生物素酰基化反应是利用生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯，琥珀酰亚胺基可以与抗体上的自由氨基结合，通常是赖氨酰侧链。比如有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基苯酯（pBNP），其中以BNHS最常用。近年来，应用活化长臂生物素标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。较长的空间桥联臂可以使偶联物更容易接近生物素，其柔韧性也更好，尽管也更容易出现非特异结合。某些空间桥联臂可以劈开，这样就可在一定的控制条件下将抗体释放出来，在某些情况下，空间桥联臂起决定性作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含二硫键长臂生物素及其制备方法，该化合物可应用于生化检测领域，减少位阻效应的影响，提高检测的灵敏度。

本发明的含二硫键长臂生物素结构如下：

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本发明的制备方法以生物素为原料，经酰化乙二胺、二硫代丙酸酰化、活性酯合成制备了含二硫键生物素，反应式如下：

实现本发明的具体技术方案是：

先将生物素与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到活性酯，然后与乙二胺一锅法反应得到生物素酰乙二胺，其结构如下：

再将生物素酰乙二胺与单N-羟基琥珀酰亚胺二硫代二丙酸酯反应生成生物素酰乙二胺二硫代二丙酸，其结构如下：

最后将得到的上述二硫代丙酸生物素类化合物与N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应制备本发明的含二硫键长臂生物素。

优选的是，包括以下具体步骤：

A、制备生物素酰乙二胺