[发明专利]抗蚜虫基因PPA-7、制备、编码的蛋白及应用

说明书

本发明属于新基因的制备，特别是指抗蚜虫基因PPA‑7、制备、编码的蛋白及应用。是以掌叶半夏块茎中的RNA反转录所合成的cDNA为模板,以5'‑ATGGCCTCCAAGCTCCTCCTCT‑3'为5’端上游引物PPAF，以5'‑CTACTCCGCAGCAATGGAGCGC‑3'为3’端下游引物PPAR，采用PCR扩增方法获得抗蚜虫基因PPA‑7，应用其编码了对蚜虫具有致死功能的蛋白。本发明解决了目前现有技术中具有抗虫活性的凝集素基因不能完全抑制蚜虫发育和繁殖、现有基因序列较长等问题，具有杀虫周期短、蚜虫致死效果强的作用，在转基因作物上应用更为简单、经济和有效，可避免基因长度太长引起的能量消耗，更适合用于转基因作物的抗蚜虫改良。

技术领域

本发明属于新基因的制备，特别是指抗蚜虫基因PPA-7、制备、编码的蛋白及应用。

背景技术

虫害是造成农业减产的重要原因之一，全球每年因管理和利用化学杀虫剂防治费用高达100亿美元。即使如此，每年虫害导致损失占农作物总产量的20％－30％。与化学药剂相比，利用抗虫基因资源开展作物抗虫遗传育种是最经济有效和安全的措施，但是传统育种方法培育抗虫品种技术难度大、周期长，很难获得突破性的进展。转基因抗虫植物的出现为防治植物病虫害开拓了新的思路，利用Bt抗虫转基因的植物取得了显著的成果，但是使用Bt基因抗源单一，且这类基因不能有效防治某些刺吸式害虫如蚜虫等害虫，尤其是这些重要的农业昆虫还是植物病毒的传播介体，因此筛选新的抗虫基因尤其是抗蚜虫的基因具有重要的意义。

目前已开发的众多抗虫基因资源中，唯有植物凝集素能有效控制同翅目害虫。植物凝集素是一类能可逆和糖结合的蛋白质，可凝集人和动物的红细胞，具有多种活性功能，如抗虫、抗病毒、抗真菌等，但其最重要的功能还是体现为对同翅目害虫的抗性。植物凝集素是目前所知的唯一可以识别并结合昆虫肠胃及真菌、细菌等微生物表面的糖缀合物的植物蛋白，在植物中广泛存在，按氨基酸序列同源性和进化相关性分类为7个不同的植物凝集素家族，主要有豆科凝集素、单子叶甘露糖结合凝集素、几丁质结合凝集素、2型核糖体失活蛋白、木菠萝(jacalin)家族、葫芦科韧皮部凝集素、苋科凝集素等。人工饲喂试验及转凝集素基因植株的抗虫分析均表明，植物凝集素能显著抑制多种同翅目害虫(如蚜虫、褐飞虱等)的生存和繁殖。研究表明植物凝集素的抗虫活性与其特异性结合糖类的能力有关，能与同翅目昆虫消化道上皮细胞的糖蛋白结合，降低了昆虫消化道膜的通透性，影响营养物质的正常吸收。此外凝集素还能在昆虫消化道内诱发病灶，促使消化道内细菌繁殖，使昆虫感病、拒食，生长发育受抑制甚至死亡。1998年KeyanZhu-Salzman使用定点突变技术，使豆科凝集素GSⅡ丧失了糖结合能力，发现该凝集素同时也丧失了抗虫活性。由此可见，凝集素的抗虫活性与其能与糖类可逆性结合的能力密切相关。大多数凝集素的特异结合活性通常不是针对植物细胞内的糖分子，而常常是微生物或害虫的内表面的寡糖，在结合糖的过程中植物凝集素表面局部结构的构象会有所变化，这种变化有利于识别不同的糖而结合不同的外来糖缀合物，发挥其防御功能。目前成功用于植物抗病虫基因工程的植物凝集素主要有菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin,PHA)、豌豆外源凝集素(Pea lectin，P-lec)、雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)、麦胚凝集素(Wheat germagglutinin,WGA)等。研究最多、应用最广、抗虫活性较好的为单子叶植物甘露糖结合凝集素雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin，GNA)。