[发明专利]抗可卡因单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及制备方法

权利要求书

1.产生抗可卡因单克隆抗体的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201727。

2.抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）、制备可卡因人工抗原；

（2）、通过连续短时间的快速免疫内刺激小鼠脾细胞使其产生的具有特异性的B淋巴细胞；

（3）、将上述小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用丁二酸酐与N-去甲基可卡因缩合得到含有羧基的可卡因半抗原Hapten1，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用溴乙酸乙酯亲和取代N-去甲基可卡因，用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因半抗原Hapten2，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中，小鼠免疫过程如下：将可卡因人工抗原、弗氏佐剂按1：1的体积通过注射器法乳化得到乳剂，选择6周龄的BALB/c雌鼠进行皮下免疫、腹腔免疫、静脉免疫，共免疫6次，免疫时间为第1天、第7天、第21天、第28天、第30天、32天。

7.抗可卡因单克隆抗体，其特征在于它由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生。

8.一种用于检测尿液中可卡因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

（1）携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因单克隆抗体；

（2）包被有可卡因-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。

9.制作如权利要求8所述试剂盒的方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）可卡因人工抗原的制备：

以可卡因盐酸盐为原料，游离后经高锰酸钾氧化后与溴丁酸乙酯进行亲核取代反应或者与丁二酸酐缩合或者直接水解得到含羧基的可卡因半抗原，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与载体蛋白结合制备可卡因人工抗原；

（2）可卡因单克隆抗体的制备：

提取由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因克隆抗体，纯化该单克隆抗体；

（3）胶体金的制备：

取1ml 1%氯金酸（HAuCl₄）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化，此时制得的胶体金颗粒为30nm；

（4）金标制备：

取步骤（3）中制备好的胶体金，用1M NaOH调节pH至8.5，然后加入上述抗体1份，磁力搅拌器上搅拌，然后加入一定量的BSA至终浓度0.5-2%，搅拌待用；将上述已经偶联好抗体的胶体金溶液离心，弃去沉淀，保留溶液；沉淀用含20%的蔗糖的金标抗体稀释液复溶，转入棕色瓶内保存备用；

（5）金标条的制备：

将金标工作液均匀喷到金标垫上:将喷好金标工作液的金标垫干燥切条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

（6）NC膜的包被：

将一定量的可卡因抗原偶联物和羊抗鼠多克隆抗体纯化，上述可卡因抗原偶联物及羊抗鼠多克隆抗体分别上样到点膜机的T、C柱中，T、C线溶液包被到NC膜上；将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

（7）玻纤的处理：

将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

（8）试剂条的组装：

将处理好的NC膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到PVC板上，然后切割成4.0mm条，组装好的可卡因尿液检测试剂适用于尿液可卡因的检测。