[发明专利]一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在微生物中异源表达羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2得到的重组菌；所述γ-松油烯合成酶基因TPS2来源于百里香（Thymus vulgaris），GenBank序列登记号为KR920616；所述香叶基焦磷酸合成酶（GPPS2）来源于冷衫针茅（Abiesgrandis），GenBank序列登记号为AAN01134.1；所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶mvaE来源于粪肠球菌（Enterococcusfaecalis），GenBank序列登记号为AAG02439.1；所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1均来源于酿酒酵母（SaccharomycescerevisiaeATCC 4040002），GenBank序列登记号分别为:AJS99582.1、AJS99594.1、KZV08671.1、AJU24162.1，出发菌株为大肠埃希氏菌（E. coli）。

2.一种权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到商品质粒pACYC-Dute1，得到重组质粒；

2）以商品质粒pTrcHis2B和甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1构建重组质粒pTrc-low；

3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）先将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE以串连的方式连接到商品质粒pACYC-Dute1中，得到质粒pACYC-mvaS-mvaE，再分别将香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到质粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重组质粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2；

2）以质粒pTrcHis2B和酿酒酵母S. cerevisiae ATCC 4040002的基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装pTrc-low质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并将扩增的6个SFs片段以等摩尔比例在EP管中混匀，沸水浴使其变性，室温自然冷却，得到载体连接液；之后将载体连接液转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养过夜后，进行菌落PCR，鉴定并得到重组质粒pTrc-low；

3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌。

4.权利要求1所述的基因工程菌在生物合成γ-松油烯中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌是以甘油或葡萄糖为原料生物合成γ-松油烯的。