[发明专利]一种OsGA3ox1基因在水稻雄性不育株系创制中的应用

权利要求书

1.一种应用水稻OsGA3ox1基因创制水稻雄性不育株系的方法，其特征在于，所述的方法包含步骤：利用CRISPR/Cas9系统对普通水稻中的OsGA3ox1基因进行定点敲除，培育，获得水稻雄性不育株系：

1)利用公开软件CRISPR-P设计针对OsGA3ox1基因的sgRNA引导序列；

2)根据设计的sgRNA引导序列及载体构建要求，合成末端四个碱基外其余碱基反向互补的寡脱氧核糖核酸sgG3x1U3-F：ggcaCATCTGCTTCGGGTACCGG和sgG3x1U3-R：aaacCCGGTACCCGAAGCAGATG，以及sgG3x1U6-F：cttgACTCGTCGATGAGAGCTCT和sgG3x1U6-R：aaacAGAGCTCTCATCGACGAGT；

3)分别把反向互补寡脱氧核糖核酸退火成双链寡核酸；

4)酶切、连接和转化，分别把所得的双链寡核酸连接到CRISPR/Cas9载体；

5)测序，选取正确克隆，扩大繁殖提取质粒，其中，测序前先挑单克隆，以如下引物对单克隆进行测序，

OsU3-F：GGCATGCATGGATCTTGGAGGAAT，检测克隆正确性，启动子为OsU3时用，

OsU6-F：TTGAGCGATTACAGGCGAAAGTG，检测克隆正确性，启动子为OsU6时用，

35S-F：TGACGCACAATCCCACTATCCTTC，35S正向引物，检测载体完整性，

Cas9-R-1：TCGAGCCTGCGGGACTTAGAG，cas9 5′端引物，检测载体完整性，

C126：TCGTGAAGAAGACCGAGGTT，cas9 3′端引物，检测载体完整性；

6)转化农杆菌；

7)转化水稻愈伤组织，获得T0代转化子；

8)对T0代转化子中OsGA3ox1基因的靶位点进行测序检测，具体为，

提取转化子DNA，分别利用G3x1U3-F：TCGCGCTGCCGGCGGACGAC和G3x1U3-R：GCGGATGGCAGGGGGAGGGAAGGT，以及G3x1U6-F：TCGATCCGCCATTGCTTGCAT和G3x1U6-R：CCGAGCGCCTTGAAGAACATGG组成的引物对对转化子OsGA3ox1基因组DNA中的sgRNA引导序列进行扩增，将扩增片段克隆至T载体，转化大肠杆菌，挑单克隆测序，每个片段至少测10个单克隆以上，至少获得5个阳性克隆；

9)判定突变情况，具体为，

将测序结果与野生型序列进行比对，分析，结果存在四种可能，无突变，纯合突变、杂合突变或双等位基因突变；

10)观察突变转化子表型，判定OsGA3ox1基因敲除情况，具体为，

观察T0代OsGA3ox1基因突变转化子表型，包含花粉I2-KI染色情况，散粉情况，结实情况是否受影响；

根据花粉I2-KI染色判定OsGA3ox1基因是否敲除，若一转化子中一半左右花粉I2-KI染色较正常花粉浅，则该突变转化子中有一个等位基因完成OsGA3ox1基因敲除，若几乎全部花粉染色都比正常花粉浅，则两个OsGA3ox1等位基因都完成敲除，若染色与野生型无异，则突变并不影响基因功能；

11)按照10)确定的等位基因敲除类型选择赤霉素喷施方案实施喷施，获得水稻雄性不育株系。

2.一种通过权利要求1所述的方法创制的水稻雄性不育株系的育性恢复方法，其特征在于，所述的育性恢复方法为向所述水稻雄性不育株系穗部喷施赤霉素类物质的水溶液，所述赤霉素类物质为GA3，所述喷施的时期是在水稻孕穗期至扬花期，所述喷施的时间为早上6-9点或下午4-6点中的一种，所述喷施的次数为2～8次，所述喷施的赤霉素类物质的浓度为5～90mg/L。

3.根据权利要求2所述的水稻雄性不育株系的育性恢复方法，其特征在于，所述喷施的次数为3～5次，所述喷施的赤霉素类物质的浓度为20～40mg/L。

4.一种通过权利要求1所述的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻杂交种制种中的应用，其特征在于，在制种中，水稻雄性不育株系作为母本而种植。