[发明专利]抗DOG1蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合DOG1蛋白的单克隆抗体OTI1C6、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

DOG1(Discovered on gastrointestinal stromal tumors protein 1)是2004年由West等利用cDNA微阵列技术筛选出的一个特异性高表达于胃肠道间质瘤((gastrointestinal stromal tumor,GISTs)的基因，别名ORAOV2、TMEM16A、FLJ10261和ANO1，定位于人染色体11q13位点，含有26个外显子码产物为986个氨基酸组成，相对分子质量为114kD。该蛋白有8个穿膜的功能区，研究表明其可能是钙离子调控的氯离子通道蛋白。

研究证实，DOG1蛋白选择性高表达于GISTs，对上皮样胃间质瘤、PDGFRα突变间质瘤、胃肠道外间质瘤、转移性间质瘤以及儿童间质瘤都有良好的灵敏度及特异度，DOG1在GISTs中的表达率为90％～95％，是一种较敏感、特异的标志物且其表达并不依赖于KIT或PDGFRα基因突变情况。临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对DOG1蛋白的单克隆抗体对IHC检测DOG1表达水平具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的DOG1蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测DOG1蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2017年4月6日，保藏编号为CGMCC No.13821。

本发明还提供了一种特异性结合DOG1蛋白的单克隆抗体OTI1C6，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据DOG1 ORF核苷酸序列(DOG1 ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，2961bp；DOG1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增DOG1 ORF第1bp位到第999bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建DOG1氨基酸序列第1位到第333位的重组表达质粒pET23a-rDOG1；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCATGAGGGTCAACGAGAAGT下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTCTAGGCGAAGTACAGGCCGATC

(2)DOG1重组蛋白的表达与纯化：将DOG1重组表达质粒转化E.Coli细胞，裂解离心获得上清，镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的DOG1重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的DOG1重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗DOG1特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为OTI1C6，亚型鉴定为IgG2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得DOG1单克隆抗体OTI1C6。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体OTI1C6在制备用于检测DOG1蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体OTI1C6，可检测组织细胞中DOG1的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与DOG1的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于胃肠道间质瘤、直肠癌。