[发明专利]一种快速区分玉米小斑病菌交配型的PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种快速区分玉米小斑病菌交配型的PCR检测方法，采用两对特异引物是ChMAT01‑4和ChMAT02‑3，通过改良的CTAB法提取待检测样本的基因组DNA，PCR扩增结果用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用凝胶成像系统记录电泳结果，利用DL2000的DNA Marker判断DNA片段的大小。本发明提供了一种更加便捷、快速的检测玉米小斑病菌交配型的PCR检测方法，其检测结果更加可靠、特异和稳定，适用于大批量的玉米小斑病菌交配型的快速检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速区分玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）交配型的PCR检测方法。本发明技术适用于对单孢分离获得的玉米小斑病菌交配型的检测。

技术背景

真菌的有性生殖可分为同宗配合（Homothallism）和异宗配合（Heterothallism）两大类。在同宗配合的真菌中有性生殖是由交配可亲和的一对雌、雄配子结合产生有性孢子从而形成新个体的繁殖方式，有性生殖是真菌界普遍存在的一种生殖方式。可见，异宗配合真菌必须由不同性别的菌丝细胞结合后才能产生子代的一种生殖方式。真菌的有性繁殖和交配亲合性主要受交配型基因的控制，同宗配合的真菌通常具有一个交配型基因位点；而大多数异宗配合的真菌同时具有一对高度异源的交配型基因位点。在异宗配合的子囊菌中，具有MAT1-1和MAT1-2两个高度异源的交配型基因位点。因此，可通过检测MAT1-1和MAT1-2基因从而确定异宗配合的子囊菌的交配型。

由玉米小斑病菌（有性态：Cochliobolus heterostrophus；无性态：Bipolaris maydis）引起的玉米小斑病是玉米上的重要叶部病害，该病害遍及亚洲、美洲、欧洲、非洲和大洋洲等玉米产区，是玉米产区普遍发生的重要病害之一。玉米小斑病菌在整个玉米生长期均可感染、危害，特别是玉米抽穗以后发生较重，此病主要危害叶片，也能危害叶鞘、苞叶、果穗和子粒。病害先发生于下部叶片，逐渐向上部叶片蔓延。一般在抗病品种上产生黄褐色坏死小斑点，周围有黄褐色晕圈，病斑不扩大，在感病品种上病斑椭圆形或纺锤形，病斑扩展受叶脉限制（或不受限制），黄褐色，边缘深褐色。在多雨潮湿时病斑上可产生灰黑色霉层（分生孢子梗和分生孢子），严重时病斑扩展到整个植株，导致整株玉米枯死。研究表明，玉米小斑病菌属子囊菌门旋孢腔菌属的异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型。

申请人根据Turgeon et al. (Molecular Genetics and Genomics, 1993, 238(1): 270-284) 登录在GenBank中的两种玉米小斑病菌交配型MAT1-1基因序列（GenBank登录号: X68399）和MAT1-2基因序列（GenBank登录号: X68398），设计了两对特异性引物用于检测玉米小斑病菌的交配型。与传统的交配型检测方法相比较，本发明大大缩短了检测玉米小斑病菌交配型的周期，其检测结果更加准确、快速和高效。同时，本发明为研究玉米小斑病菌的有性世代及其遗传变异奠定了实验基础。

本发明基于GenBank 中登录的两对玉米小斑病菌交配型基因序列，通过设计特殊引物和PCR反应条件的优化，保证了检测结果的可靠、特异和稳定性。该方法可快速检测经单孢分离获得的玉米小斑病菌菌株的交配型，适用于玉米小斑病菌及其交配型的流行预测及植物病理学相关领域的科学研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、检测结果可靠、特异和稳定，且易于操作的检测玉米小斑病菌交配型的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：