[发明专利]一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法

权利要求书

1.一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，包括以下实验步骤：

步骤一、转化态纳米材料母液的配制：将纳米氧化锌分散于超纯水中，然后用氢氧化钠溶液调节pH值，配置成浓度为1mg/ml的原初态纳米材料储备液，高温、高压灭菌后，室温避光保存，每隔10天对所述原初态纳米材料储备液进行数据表征，直至数据结果显示所述原初态纳米材料储备液的物化性质发生改变，即得转化态纳米材料母液，备用；

步骤二、原初态和转化态纳米材料致哺乳动物细胞恶性转化的慢性处理，操作如下：

A.将正常小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用含10％胎牛血清的DMEM培养基在培养箱中培养；

B.分别取两皿处于对数期的、满度为80％的MEF细胞，经胰蛋白酶消化后分别种植于60mm培养皿中，培养24小时，待细胞生长至对数生长期后，弃去原培养基溶液；向其中一个培养皿中加入稀释后的所述原初态纳米材料储备液与含10％胎牛血清的DMEM培养基混合液；向另一个培养皿中加入稀释后的所述转化态纳米材料母液与含10％胎牛血清的DMEM培养基混合液；培养24小时后，去除每个培养皿中的培养基混合液，每皿细胞用1.5ml磷酸盐缓冲液漂洗3遍，漂洗后，每个培养皿细胞中再加入4ml含10％胎牛血清的DMEM培养基连续培养3天；待长满后，用胰蛋白酶酶解消化后开始第二轮纳米材料的慢性处理；循环操作，连续暴露60代完成慢性暴露的过程；

步骤三、用原初态和转化态纳米材料诱发裸鼠成瘤：将4周龄的雌BALB/c裸鼠，SPF级环境中饲养一周后，提取步骤二中正处于对数生长期的、经过原初态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的MEF细胞和经过转化态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的MEF细胞组成细胞悬液，将所述细胞悬液在无菌培养室内接种至裸鼠皮下，诱发成瘤。

2.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，还包括步骤四：

步骤四、对小鼠进行病理研究：待所述步骤三中的裸鼠有肉眼可见的瘤体后，每隔1天对所述瘤体的体积进行测量；提取裸鼠肝、肺和脾器官细胞，对所述肝、肺和脾器官细胞进行检测。

3.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤二的操作A中所述培养箱为二氧化碳培养箱。

4.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤二的操作B中所述稀释后的原初态纳米材料储备液浓度为1.5μg/ml，稀释后的转化态纳米材料母液浓度也为1.5μg/ml。

5.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，其特征在于，步骤一中所述纳米氧化锌的粒径为20nm。

6.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤二的操作B中所述两皿处于对数期的、满度为80％的MEF细胞，经胰蛋白酶消化后分别用细胞计数仪计数，种植的细胞数量均为1*10⁵个。

7.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤二的操作B中所述连续暴露60代完成慢性暴露的过程中，其中在连续暴露60代的过程中，从第一代开始计算，期间每隔5-10代冻存部分细胞。

8.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤三中所述细胞悬液中的经过原初态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的MEF细胞和经过转化态纳米氧化锌慢性刺激达6个月的并发生恶性转化的MEF细胞浓度均为1*10⁷/100μl。

9.如权利要求1所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤三中所述细胞悬液在无菌培养室内接种至裸鼠的腋下。

10.如权利要求2所述的一种转化态纳米材料致哺乳动物癌变的方法，其特征在于，步骤四中在对所述瘤体的体积进行测量时，用游标卡尺分别测量肿瘤垂直方向上的最长直径a和最短直径b，肿瘤体积V＝0.5*a*b²。